Base Editors und Prime Editors beginnen, ihr klinisches Versprechen zu verwirklichen

Das wissenschaftliche Team von EmendoBio nutzt die proprietären Plattformen des Unternehmens, um CRISPR-basierte Therapeutika der nächsten Generation zu entwickeln. Eine Nuklease-Entdeckungsplattform wird verwendet, um den zielgerichteten Bereich des Genoms zu erweitern, und eine zielspezifische Optimierungsplattform wird verwendet, um eine hochpräzise Genbearbeitung, einschließlich allelspezifischer Bearbeitung, zu ermöglichen und gleichzeitig hohe Effizienzen beizubehalten und Off-Target-Effekte zu vermeiden. Das Unternehmen gibt an, maßgeschneiderte Nukleasen und RNA-Leitfäden für viele Krankheiten entwickeln zu können, die bisher als unheilbar galten.

Von MaryAnn Labant

Im Jahr 2016 veröffentlichte eine Gruppe von Forschern unter der Leitung von David Liu, Ph.D. von Harvard, einen Artikel in Nature, der über die Entwicklung des Base-Editing berichtete. Sie schrieben, dass die Basenbearbeitung „ein neuer Ansatz zur Genombearbeitung ist, der die direkte, irreversible Umwandlung einer Ziel-DNA-Base in eine andere auf programmierbare Weise ermöglicht, ohne dass eine doppelsträngige DNA-Rückgratspaltung oder eine Spendervorlage erforderlich ist.“ Sie fügten hinzu, dass die Basenbearbeitung das Risiko von Off-Target-Mutationen verringern könne und das Potenzial habe, „eine Vielzahl von Punktmutationen, die für menschliche Krankheiten relevant sind, effizient zu korrigieren“.

Ähnliche Arbeiten wurden damals von Keiji Nishda, PhD, und seinen Kollegen an der Universität Kobe durchgeführt. Seitdem wurden von akademischen und kommerziellen Forschern viele weitere Basisbearbeitungssysteme entwickelt. Und das ist nicht alles. Im Jahr 2019 wurde ein weiteres Genom-Editierungssystem eingeführt, das doppelsträngige DNA-Brüche vermeiden kann. Dieses System wird Prime Editing genannt und wurde nicht zufällig von Forschern unter der Leitung von Liu entwickelt.

„[Prime Editing ist] eine vielseitige und präzise Genomeditierungsmethode, die mithilfe einer katalytisch beeinträchtigten Cas9-Endonuklease, die mit einer manipulierten Reverse Transkriptase fusioniert ist und mit einer Prime Editing Guide RNA (pegRNA) programmiert ist, die beide spezifiziert, direkt neue genetische Informationen in eine bestimmte DNA-Stelle schreibt die Zielseite und kodiert die gewünschte Bearbeitung“, schreiben die Forscher in Nature. „Prime Editing … weist ergänzende Stärken und Schwächen im Vergleich zum Base Editing auf und induziert an bekannten Off-Target-Standorten von Cas9 eine viel geringere Off-Target-Editierung als die Cas9-Nuklease. Prime Editing erweitert den Umfang und die Möglichkeiten der Genom-Editierung erheblich und könnte im Prinzip eine Korrektur bewirken.“ bis zu 89 % der bekannten genetischen Varianten, die mit menschlichen Krankheiten verbunden sind.“

Derzeit werden Basis-Editing- und Prime-Editing-Systeme für klinische Anwendungen entwickelt. In diesem Artikel werden mehrere solcher Systeme vorgestellt. Obwohl diese Systeme auf dem neuesten Stand sind – oder besser gesagt, auf dem neuesten Stand sind – müssen sie dennoch bekannte Herausforderungen wie Verpackung und gezielte Lieferung bewältigen.

„Wir glauben, dass Prime Editing sehr spezifisch und präzise ist, da die Prime Editing-Maschinerie drei Annealing-Schritte durchlaufen muss, um eine genetische Veränderung herbeizuführen“, sagt Keith Gottesdiener, MD, Präsident und CEO von Prime Medicine. „Es ist unwahrscheinlich, dass es an der falschen Stelle landet und alle drei Schlüssel entriegelt.“

Laut Gottesdiener kann Prime Editing die 12 verschiedenen Fehlpaarungen einzelner Basenpaare korrigieren, kleine Indel-Mutationen reparieren und große Genomsequenzen entfernen und ersetzen – alles auf programmierbare Weise. „Beim programmierbaren Schnitt erfolgt der Schnitt zielgenau“, betont er. „Wir können ein Basenpaar auswählen, an dem eine Bearbeitung stattfinden soll. Und da die Maschinerie läuft und von einer kleinen gRNA gesteuert wird, können wir diese austauschen und an eine andere Stelle im Genom wechseln.“

Prime Editing funktioniert in einer Vielzahl sich schnell teilender oder ruhender Zellen. Bei einer einmaligen Behandlung wird die DNA am normalen genetischen Ort in den Wildtyp zurückgeführt.

„Wir haben die ursprüngliche Technologie weiterentwickelt und verbessert“, betont Gottesdiener. „Es ist fast zu schön, um wahr zu sein.“ Er warnt jedoch davor, dass „die Bereitstellung der Technologie an einem beliebigen Standort mit ähnlichen Herausforderungen verbunden ist, wie sie auch andere gesehen haben.“ Zu den bekannten Verabreichungsoptionen gehören Elektroporation für Ex-vivo-Anwendungen; Lipid-Nanopartikel (LNPs) zur gezielten Behandlung der Leber; und Adeno-assoziierte Virus-Vektoren (AAV) zur gezielten Bekämpfung anderer strategischer Standorte.

Prime Medicine verfügt über eine breite Pipeline. Obwohl eine solche Pipeline dem Unternehmen eine Reihe von Optionen bietet, stellt sie auch eine Herausforderung für das Management dar. „Alle Indikationen könnten in die Klinik gelangen“, stellt Gottesdiener fest. „Einige Programme werden jedoch schneller voranschreiten, bei einigen werden wir Partner sein und andere werden beschnitten.“

In der ersten Pipeline liegt der Schwerpunkt auf Sofortindikationen und Differenzierungsprogrammen. Prime wählte diese Indikationen nach Abwägung von Überlegungen wie definierter Genetik, neuen medizinischen Prioritäten, Beiträgen von Primes Vordenkerpartnern sowie regulatorischen und Bereitstellungsherausforderungen aus. Das Differenzierungsprogramm konzentriert sich auf einzigartige Krankheitsmerkmale wie die Bekämpfung wiederholter Ausbreitungen bei der Huntington-Krankheit, einer Form der amyotrophen Lateralsklerose und einigen Formen der Ataxie. Prime plant, im Jahr 2024 einen IND für seine erste Indikation, die chronische granulomatöse Erkrankung, einzureichen.

Giuseppe „Pino“ Ciaramella, PhD, Präsident von Beam Therapeutics, stellt fest, dass die Basenbearbeitung die CRISPR-basierte Technologie auf zwei entscheidende Arten verändert. Erstens muss die Basenbearbeitung keine doppelsträngigen Brüche bewirken, die zu genomischen Neuordnungen und anderen unerwünschten Folgen führen können. Zweitens fusioniert das Baseneditieren typischerweise das CRISPR-Protein mit einem zusätzlichen menschlichen Protein, einer Desaminase, die in der Lage ist, eine Nukleobase direkt auf dem Gen chemisch in eine andere umzuwandeln.

Eine Einschränkung von Basiseditoren besteht darin, dass sie nur bestimmte Arten von Bearbeitungen einzelner Basenpaare durchführen. Das heißt, sie können nur Übergangsmutationen (Purin zu Purin oder Pyrimidin zu Pyrimidin) durchführen, keine Transversionsmutationen (Purin zu Pyrimidin oder Pyrimidin zu Purin). Sie können nicht verwendet werden, um Insertionen oder Deletionen durchzuführen oder einen beliebigen DNA-Abschnitt zu ersetzen. Da es sich jedoch um Werkzeuge handelt, mit denen Übergangspunktmutationen mit hoher Präzision und Effizienz durchgeführt werden können, haben Baseneditoren Potenzial für eine Vielzahl therapeutischer Anwendungen.

Das Fehlen doppelsträngiger Unterbrechungen bietet einen erheblichen Vorteil, da mehrere gleichzeitige Bearbeitungen möglich sind. Ein System, das diese gleichzeitigen Änderungen ausnutzt, ist eine Beam-Plattform namens Engineered Stem Cell Antibody Paired Evasion (ESCAPE). Es kombiniert eine antikörperbasierte Konditionierung mit multiplexgeneditierten hämatopoetischen Stammzellen.

„Wir können eine Bearbeitung vornehmen, die darauf abzielt, die Sichelzellenanämie zu modifizieren, sowie eine Bearbeitung, die die bearbeiteten Zellen resistent gegen einen maßgeschneiderten Antikörper macht, der selektiv auf unbearbeitete Zellen abzielen und eine Nische im Knochenmark schaffen kann, die es den bearbeiteten Zellen ermöglicht, sich anschließend einzupflanzen.“ eine Transplantation“, erklärt Ciaramella. Dies kann im Gegensatz zur aktuellen Standardbehandlung, die zu Sterilität und anderen Nebenwirkungen führen kann, eine ungiftige Konditionierungskur ermöglichen.

Das Unternehmen nutzt klinisch validierte Liefertechnologien, um mRNA zu liefern, die den Editor kodiert. Ex-vivo-Programme nutzen Elektroporation und In-vivo-Programme verkapseln die mRNA in LNPs, die auf die Leber abzielen können. Es werden neuartige LNP-Formulierungen entwickelt, die auf andere Gewebe wie Immunzellen oder Stammzellen im Knochenmark abzielen.

Beams führendes Programm für Sichelzellenanämie, BEAM-101, ist das erste klinische Basisbearbeitungsprogramm in den USA. Ciaramella weist darauf hin, dass das Regulierungspaket von Beam mit dem übereinstimmte, was für andere Ex-vivo-Programme zur Genbearbeitung erforderlich ist.

Zusätzlich zur Entwicklung seiner Basisbearbeitungstechnologie arbeitet Beam mit anderen Unternehmen zusammen. Durch eine Vereinbarung mit Prime Medicine hat Beam das ausschließliche Recht, Prime-Editing-Technologie für die Erstellung oder Korrektur von Einzelbasen-Übergangsmutationen sowie für die Behandlung von Sichelzellenanämie zu entwickeln. Außerdem arbeitet Beam mit Verve Therapeutics zusammen. Im Rahmen dieser Zusammenarbeit hat Verve exklusiven Zugriff auf die Basisbearbeitungs-, Genbearbeitungs- und Verabreichungstechnologien von Beam für humantherapeutische Anwendungen gegen bestimmte kardiovaskuläre Ziele. Obwohl Beam auch Zugang zur RNA-Bearbeitungstechnologie hat, hat das Unternehmen laut Ciaramella keine Anwendungen gefunden, bei denen die RNA-Bearbeitung einen Vorteil gegenüber der DNA-Bearbeitung bieten würde.

Der Kardiologe und Wissenschaftler Sekar Kathiresan, MD, hebt drei Erkenntnisse über Herz-Kreislauf-Erkrankungen hervor, die aus der Humangenetikforschung hervorgegangen sind. Erstens: Wenn der Cholesterinspiegel im Blut einer Person im Laufe ihres Lebens niedrig ist, ist es sehr unwahrscheinlich, dass sie einen Herzinfarkt entwickelt. Zweitens tragen einige Personen, die gegen Herzkrankheiten resistent sind, Mutationen – Resistenzmutationen –, die auf natürliche Weise cholesterinsteigernde Gene ausschalten. Drittens beeinflussen drei der Resistenzmutationen den Cholesterinweg des Low-Density-Lipoproteins (LDL), vier von ihnen den Cholesterinweg des triglyceridreichen Lipoproteins (TRL) und eine davon das Lipoprotein(a) (Lp(a)). Cholesterinweg.

„Die CRISPR-Technologie ermöglichte es uns, ein Medikament zu entwickeln, das diese natürlichen Resistenzmutationen nachahmt“, fährt Kathiresan fort. Mit „uns“ meint er das Entwicklungsteam von Verve Therapeutics, dem Unternehmen für genetische Medikamente, dessen Mitbegründer und CEO er ist. „Unsere einmaligen Gen-Editing-Medikamente“, behauptet er, „zielen darauf ab, den Cholesterinspiegel im Blut dauerhaft zu senken.“

VERVE-101, der am weitesten fortgeschrittene Produktkandidat des Unternehmens, zielt auf das PCSK9-Gen ab, um den LDL-Cholesterinspiegel zu senken. VERVE-201, der nächstfortschrittliche Produktkandidat des Unternehmens, zielt auf das ANGPTL3-Gen ab, um den TRL-Cholesterinspiegel zu senken. Sowohl die Programme VERVE-101 als auch VERVE-201 basieren auf der Basisbearbeitungstechnologie. Um auf das LPA-Gen abzuzielen und den Lp(a)-Cholesterinspiegel zu senken, entwickelt Verve einen benutzerdefinierten Editor.

Die Lieferung profitiert von der Verfeinerung. Standard-LNPs sind kleine Fettblasen, die Fracht transportieren. Im Fall von VERVE-101 besteht die Ladung aus der mRNA für den CRISPR-Base-Editor sowie einer gRNA, die den Editor zum PCSK9-Gen leitet. „Wir haben einem Standard-LNP einen Liganden, ein GalNAc-Zuckermolekül, hinzugefügt“, sagt Kathiresan. „Da der GalNAc-Rezeptor nur auf Hepatozyten exprimiert wird, hat ein GalNAc-LNP das Potenzial, wirksamer und spezifischer zu sein.“

VERVE-101 befindet sich derzeit in einer Phase-I-Studie namens Heart-1, um die Sicherheit und Wirksamkeit bei Patienten mit heterozygoter familiärer Hypercholesterinämie (HeFH), einer genetischen Form von hohem Cholesterinspiegel und vorzeitiger Herzerkrankung, zu bewerten. HeFH ist eine krankhafte Krankheit, die durch stark erhöhte LDL-Cholesterinspiegel im Blut und vorzeitige atherosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen gekennzeichnet ist. Aktuelle LDL-Cholesterin-senkende Therapien mit täglichen Tabletten oder intermittierenden Injektionen stellen eine hohe Behandlungsbelastung für Patienten, Anbieter und das Gesundheitssystem dar, und weniger als 5 % der HeFH-Patienten weltweit erreichen die LDL-Cholesterin-Zielwerte.

Die Herz-1-Studie läuft derzeit in Neuseeland und im Vereinigten Königreich. Klinische Daten werden noch in diesem Jahr erwartet. Das Unternehmen arbeitet mit der FDA an der Eröffnung eines IND in den Vereinigten Staaten.

Klinische Anwendungen der CRISPR-Cas9-Technologie müssen Sicherheit und Flexibilität beweisen, sagt David Baram, PhD, Präsident und CEO von Emendo Biotherapeutics. Bei der Sicherheit geht es seiner Meinung nach vor allem darum, Nebenwirkungen außerhalb des Ziels zu vermeiden. „CRISPR-Cas9 zielt hauptsächlich auf das ab, was es reduzieren soll“, sagt Baram. „Aber meistens reicht es für die Sicherheit in seiner Wildtypform nicht aus.“ Im Hinblick auf die Flexibilität betont er die Notwendigkeit mehrerer Lösungen: „Um Krankheiten möglichst effektiv behandeln zu können, ermöglicht ein Portfolio von Bearbeitungsstrategien die gezielte Behandlung von mehr Krankheiten und Loci auf bestimmten Genen.“

Die vielleicht bekannteste Nuklease bei der Genbearbeitung ist die aus dem Bakterium Streptococcus pyogenes isolierte Cas9-Variante (SpCas9). Es gibt jedoch Tausende anderer Nukleasen, von denen einige hinsichtlich der Aktivität, der Anzahl der Angriffsstellen, der Spezifität und der Verpackungseffizienz überlegen sind. Ein Nukleasen-Panel bietet die Möglichkeit, die beste Nuklease zur Behandlung einer bestimmten Krankheit zu finden. „Unsere Nukleasen sind hochaktiv und sehr präzise und können 90 % des menschlichen Genoms angreifen“, behauptet Baram. „SpCas9 deckt weniger als 10 % ab.“

Ein Team aus Computerexperten und Wissenschaftlern erstellt die Gruppe der Nukleasen. Die Engineering-Plattform des Unternehmens passt diese Wildtyp-Nukleasen dann für bestimmte Zwecke an. Ein Beispiel ist die allelspezifische Bearbeitung einer autosomal-dominanten Erkrankung, bei der es ein gesundes Allel und ein mutiertes Allel gibt. „Wir können auf das mutierte Allel abzielen, selbst wenn es nur einen geringfügigen Unterschied in einem einzelnen Nukleotid aufweist“, erklärt Baram. Dies hat die Möglichkeit eröffnet, autosomal-dominante Erkrankungen in einem einzigen Schritt zu behandeln.

Emendos Hauptindikation ist schwere angeborene Neutropenie, eine Störung der Reifung von Neutrophilen, die schließlich zu einer Immunschwäche führt und die Patienten sehr anfällig für bakterielle Infektionen macht. Die Standardtherapie der Krankheit umfasst Injektionen des Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktors, der zur Wiederherstellung der Funktion des Immunsystems beitragen kann. Um die Krankheit zu behandeln und hoffentlich zu heilen, hat Emendo eine neuartige CRISPR-basierte Ex-vivo-Geneditierungsstrategie (OMNI A1) entwickelt, die die spezifische Entfernung eines krankheitsverursachenden mutierten Allels des ELANE-Gens beinhaltet. Emendo plant, dass es bis Ende 2023 in der Klinik sein wird.

Eine Behandlung der familiären Hypercholesterinämie ist ebenfalls in Planung. Bei dieser Behandlung wird das LDLR-Gen (das den LDL-Rezeptor kodiert) und nicht das PCSK9-Gen (das ein Protein kodiert, das die LDL-Rezeptor-Expression kodiert) gezielt angegriffen, um die Expression des LDL-Rezeptors auf der Oberfläche von Hepatozyten zu erhöhen und LDL-Cholesterin aus den Hepatozyten zu entfernen Blut in die Zellen. Die Bearbeitungsstrategie entfernt ein regulatorisches Element im LDLR-Gen, das die Expressionsniveaus des LDL-Rezeptors auf der Oberfläche der Membran direkt beeinflusst. Daten zeigen, dass die Anwendung dieses Ansatzes die zelluläre LDL-Aufnahmemenge um das Dreifache erhöht, als wenn man PCSK9 ausschaltet und gleichzeitig Statine verabreicht.

Die Pin-point™ Base Editing-Plattform von Revvity for Life Sciences umfasst die folgenden Elemente: eine gRNA; eine Nickase (basierend auf Cas9 oder einem ähnlichen Protein, um die Entstehung doppelsträngiger DNA-Brüche zu vermeiden); und eine Desaminase (oder ein anderes Effektormolekül). Das System wird unter Verwendung eines Aptamers auf der gRNA und eines Aptamer-bindenden Proteins auf der Desaminase oder einem anderen Effektormolekül zusammengesetzt.

Was unterscheidet die Pin-point Base Editing Platform von anderen Basis-Editing-Systemen? Bei der Pin-Point Base Editing Platform sind die Desaminase und die Nickase nicht miteinander fusioniert. Verschiedene Desaminasen und Nickasen können unabhängig voneinander ausgetauscht werden.

„Durch die Verwendung einer gRNA ohne Aptamer ist es möglich, die Nicking-Funktion des nCas9 gezielt einzusetzen, um DNA-Sequenzen an Zielstellen im Genom einzufügen“, erklärt Michelle Fraser, PhD, Business Unit Manager, Pin-point Base Editing Platform, Revvity für Lebenswissenschaften. „Dies ermöglicht eine Multiplex-Bearbeitung, die das Ausschalten von Genen oder die Korrektur genetischer Fehler auf der Ebene einzelner Basen und gleichzeitig auch das Einfügen von Genen bewirkt.“

Die Pin-Point-Base-Editing-Plattform erreichte mit einem Cytosin-Base-Editor in einer Multiplex-Bearbeitung von vier verschiedenen immunogenen Loci (B2M, CD52, PDCD1 und TRAC) in T-Zellen eine Basenumwandlung von >75 % von C zu T. Alle vier dieser Loci wurden in über 50 % der bearbeiteten Zellpopulationen ausgeschaltet.

Die Pin-Point Base Editing Platform wurde auch zur Generierung von T-Zellen mit chimären Antigenrezeptoren (CAR) verwendet, in denen dieselben vier immunogenen Marker ausgeschaltet und der auf CD19 gerichtete CAR eingebaut wurde. Ein Tumorzelltötungstest bestätigte dies CAR-T-Zellen waren hochwirksam. Multiplex-Base-Editing wurde mit ähnlicher Effizienz auch in induzierten pluripotenten Stammzellen nachgewiesen.

Die Pin-Point Base Editing Platform kann von Revvity for Life Sciences lizenziert werden. Darüber hinaus ist ein gekachelter Screening-Service verfügbar, bei dem die Pin-Point-Plattform verwendet wird, um jeden verfügbaren C-Rest in einem oder mehreren Zielgenen von Interesse zu bearbeiten. Die Phänotypen der bearbeiteten Zellen werden dann verwendet, um funktionelle Domänen zu identifizieren oder vermutete genetische Varianten zu charakterisieren.

Die Palette der Enzyme – Cas-Varianten, Nickasen, Desaminasen und andere Effektoren – wächst schnell durch Enzymentdeckungsprogramme, die sich mit biodiversen Quellen befassen, sowie durch laborbasiertes Protein-Engineering und Projekte zur gezielten Evolution. Laut Revvity for Life Sciences bietet die Modularität der Pin-point Base Editing Platform eine einzigartige Möglichkeit, die Nickase und/oder Desaminase durch neu entwickelte Varianten zu ersetzen.

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