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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9243 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das mit der Parkinson-Krankheit (PD) assoziierte Protein Alpha-Synuclein (α-syn/SNCA) wird in aggressiven Melanomen stark exprimiert. Das Ziel dieser Studie war es, mögliche Mechanismen der α-syn-Beteiligung an der Melanompathogenese aufzudecken. Hier haben wir gefragt, ob α-syn die Expression der proonkogenen Adhäsionsmoleküle L1CAM und N-Cadherin moduliert. Wir verwendeten zwei menschliche Melanomzelllinien (SK-MEL-28, SK-MEL-29), SNCA-Knockout (KO)-Klone und zwei menschliche SH-SY5Y-Neuroblastomzelllinien. In den Melanomlinien führte der Verlust der α-syn-Expression zu einer signifikanten Abnahme der Expression von L1CAM und N-Cadherin und damit einhergehend zu einer signifikanten Abnahme der Motilität. Im Durchschnitt kam es bei den vier getesteten SNCA-KOs im Vergleich zu Kontrollzellen zu einer Verringerung der Motilität um 75 %. Bemerkenswerterweise stellten wir beim Vergleich von Neuroblastom-SH-SY5Y-Zellen, die kein nachweisbares α-syn aufweisen, mit SH-SY5Y-Zellen, die α-syn stabil exprimieren (SH/+αS), fest, dass die Expression von α-syn die L1CAM- und Einzelzellmotilität um 54 % steigerte. bzw. 597 %. Die Verringerung des L1CAM-Spiegels in SNCA-KO-Klonen war nicht auf einen Transkriptionseffekt zurückzuführen, sondern wir stellten vielmehr fest, dass L1CAM im Lysosom in SNCA-KO-Klonen effizienter abgebaut wird als in Kontrollzellen. Wir schlagen vor, dass α-syn das Überleben von Melanomen (und möglicherweise Neuroblastomen) fördert, da es den intrazellulären Transport von L1CAM zur Plasmamembran fördert.

Das Melanom ist ein aggressiver Hautkrebs, der aus pigmentproduzierenden Zellen, sogenannten Melanozyten, entsteht. Epidemiologische Studien haben das gleichzeitige Auftreten von Melanomen und Parkinson-Krankheit (PD)1,2 berichtet. Ein solches gleichzeitiges Auftreten ist insofern ungewöhnlich, als diese beiden Krankheiten sich insofern so stark unterscheiden, als Melanome durch unkontrollierte Zellproliferation und Parkinson durch neuronalen Zelltod gekennzeichnet sind. Melanompatienten haben im Vergleich zu gleichaltrigen und geschlechtsgleichen Kontrollpersonen ein 1,5- bis 1,85-fach höheres Risiko, an PD zu erkranken3,4, und umgekehrt haben PD-Patienten ein 1,4- bis 20-fach höheres Risiko, an invasivem Melanom zu erkranken als eine Kontrollgruppe5 ,6,7. Der Mechanismus dieses gleichzeitigen Auftretens ist unbekannt und könnte mehrere Gene2, darunter SNCA, und sogar Umweltfaktoren umfassen. Hier konzentrieren wir uns auf die Rolle von SNCA beim Melanom.

SNCA kodiert für das Protein Alpha-Synuclein (α-syn)8,9,10, das in Neuronen11,12,13 und einer Vielzahl anderer Gewebe14,15,16, einschließlich Melanomen17, exprimiert wird, wo es stark exprimiert wird. α-Syn ist ein kleines, intrinsisch entfaltetes Protein, das sich in Neuronen an Nervenenden lokalisiert, wo synaptische Vesikel angedockt sind18; es beschleunigt die Kinetik einzelner exozytotischer Ereignisse19. Ob α-syn die Exozytose in anderen Zelltypen fördert, ist nicht bekannt. Diesem einzigartigen Protein wurden viele weitere Aktivitäten zugeschrieben, da es in seiner Vielzahl an Konformationen an so viele Biomoleküle bindet, z. B. an negativ geladene Phospholipide20,21, Proteine22,23,24 und DNA25. Während α-syn im endolysosomalen System die Endozytose und Exozytose fördert19,26, kann es auch andere Funktionen haben. Die intrinsisch entfaltete Natur von α-syn macht es sehr anfällig für die Aggregation zu oligomeren und prionähnlichen, amyloidogenen Konformationen27, und einige dieser Aggregate lösen bei PD eine Neurodegeneration aus28. Paradoxerweise wurde vermutet, dass prionähnliche Aggregate von α-syn die Autophagie in Melanomzellen fördern29, was überlebensfördernd ist. Ob α-syn weitere überlebensfördernde Funktionen beim Melanom hat, ist Gegenstand dieser Studie.

In zwei Studien wurde die Auswirkung des Ausschaltens von SNCA auf die zelluläre Homöostase untersucht. Erstens verringerte der Abbau von SNCA in retinalen Epithelzellen der Maus in vitro den Spiegel des Transferrinrezeptors (TfR1) und seines mRNA-Transkripts signifikant, und eine Überexpression von α-syn erhöhte den Spiegel des TfR1-Proteins und seines mRNA-Transkripts im Vergleich zu Kontrollzellen30,31 . Der Verlust der α-syn-Expression in retinalen Epithelzellen führte dazu, dass sich TfR1-Moleküle in Golgi-Vesikeln ansammelten, was darauf hindeutet, dass α-syn für den Weg erforderlich ist, der TfR1 vom trans-Golgi zur Plasmamembran transportiert30. Zweitens wurde SNCA in der humanen kutanen Melanomzelllinie SK-MEL-28 ausgeschaltet und die SNCA-KO-Klone wurden in vitro und in einem Maus-Xenotransplantatmodell untersucht31. Der Verlust der α-syn-Expression in diesen Melanomzellen verringerte die Spiegel von TfR1 und dem Eisenexporteur Ferroportin und unterdrückte das Wachstum der SNCA-KO-Tumoren, die in Nacktmäuse transplantiert wurden, erheblich. Die Verringerung des TfR1-Spiegels in den SNCA-KO-Klonen war eine Folge seines verstärkten lysosomalen Abbaus. Die Ergebnisse dieser beiden Studien stimmen mit der Annahme überein, dass α-syn den vesikulären Transport von TfR1 fördert.

In dieser Studie wollten wir herausfinden, ob das Expressionsniveau von α-syn das Expressionsniveau von Adhäsionsproteinen beeinflusst. Insbesondere angesichts der Tatsache, dass sich TfR1 und L1CAM, ein in Neuronen und Melanomen exprimiertes Adhäsionsprotein, bei der Endozytose in 3T3-Zellen kolokalisieren32, fragten wir uns, ob α-syn die Expression von L1CAM moduliert, genau wie TfR1. Zu diesem Zweck haben wir die L1CAM-Spiegel in Melanom- und Neuroblastomzellen mit oder ohne Expression von α-syn gemessen. Darüber hinaus haben wir auch die Konzentrationen von E- und N-Cadherin sowie Vimentin untersucht, die drei Proteine ​​sind, die am Übergang vom Epithel zum Mesenchym (EMT) beteiligt sind33,34. Die EMT ist ein stark regulierter Übergang, bei dem Epithelzellen ihre Epithelmarker und Morphologie abgeben und sich in einen mesenchymalen Phänotyp umwandeln. Da Melanozyten (und Melanome) jedoch keine Epithelzellen sind, ist es eine Fehlbezeichnung zu sagen, dass Melanozyten einer EMT unterzogen werden. Wir zeigen, dass das Ausschalten von α-syn in Melanomzelllinien und die geringe Expression von α-syn in einer Neuroblastomzelllinie zu einem signifikanten Rückgang von L1CAM im Vergleich zu Kontrollzellen führen, die α-syn exprimieren. Unsere Interpretation dieser Ergebnisse ist, dass α-syn ein überlebensfördernder Faktor bei Melanomen ist, da es posttranslational wirkt, um ein hohes Maß an L1CAM und damit ein hohes Maß an Motilität aufrechtzuerhalten.

Die in dieser Studie verwendeten Zelllinien sind in Tabelle 1 aufgeführt. Jede Melanomzelllinie trägt die BRAF-V600E-Mutation35, die häufigste Mutation beim kutanen Melanom (Tabelle 1). Diese Mutation führt zu einer konstitutiven Aktivierung des RAS-RAF-MEK-ERK-Signalwegs36, was zur Proliferation führt. SH-SY5Y-Zellen, die häufig zur Untersuchung von PD37 verwendet werden, stammen aus einem Neuroblastom.

Wir untersuchten SK-MEL-28-Kontrollzellen und ihre Derivate (Tabelle 1). Die Spiegel von E-Cadherin, L1CAM, N-Cadherin, Vimentin, α-Syn und α-Tubulin wurden in Zellextrakten mittels Western Blot untersucht (Abb. 1A – D; ergänzende Abb. S1 und S2). Die normalisierten Bandenintensitäten aus einer densitometrischen Analyse der Blots sind in Abb. 1E dargestellt. Im Vergleich zu den SK-MEL-28-Kontrollzellen waren in zwei KO-Klonen L1CAM, N-Cadherin und Vimentin um 26 % (P = 0,002), 35 % (P = 0,005) und 52 % (P = 0,008) herunterreguliert ), jeweils. Im Gegensatz dazu blieb der E-Cadherin-Spiegel unverändert (Abb. 1E). Die Klone KI8 und KI9 wiesen wie die Kontrollzellen Spiegel dieser drei Proteine ​​auf.

Der Verlust von α-syn verringert EMT-ähnliche Marker und Motilität in SK-MEL-28-Zellen. (A–D) Repräsentative Western Blots von E-Cad, L1CAM, N-Cad, Vimentin, α-syn und α-Tubulin in Lysaten der in vitro kultivierten Kontroll-, KO- und KI-Zellen. (E) Quantitative Analyse der relativen Proteinspiegel. Die Intensitäten der E-Cad-, L1CAM-, N-Cad- und Vimentin-Banden werden auf α-Tubulin normalisiert. Alle Experimente wurden mit mindestens drei biologischen Replikaten wiederholt (n = 3). (F) Repräsentative Lichtmikroskopbilder von phagokinetischen Spuren, die von Kontroll-, KO8- und KI8-Zellen auf kolloidalen goldbeschichteten Vertiefungen erstellt wurden. Schwarze Pfeile markieren einzelne phagokinetische Spuren in den jeweiligen Zelllinien. Die Bilder wurden mit einem ×10-Objektiv aufgenommen und die gereinigte phagokinetische Fläche pro Zelle wurde mit der ImageJ-Software gemessen. (G) Balkendiagramme zeigen die Quantifizierung der gereinigten Flächen aus drei unabhängigen Experimenten. Mindestens 33 Spuren pro Versuchsbedingung wurden zur Quantifizierung zufällig ausgewählt. Für die statistische Analyse wurden 100 Spuren für n = 3 pro Versuchsgruppe verwendet. (E,G) Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung **, p = 0,0015–0,0027; *, p = 0,0073–0,0134, bestimmt unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA, Dunnett-Post-hoc-Test.

Angesichts der Tatsache, dass die SNCA-KO-Klone geringere Mengen an L1CAM, N-Cadherin und Vimentin exprimieren, die mit Invasion und Migration verbunden sind, fragten wir, ob die KO-Klone weniger beweglich sind als Kontrollzellen. Zu diesem Zweck verwendeten wir einen Einzelzell-Motilitätstest mit kolloidalem Gold38, um die Bewegung einzelner Zellen zu überwachen. Wenn sich eine Zelle über die Oberfläche eines mit kolloidalem Gold bedeckten Objektträgers bewegt, hinterlässt die Zelle eine Spur, auf der sich weniger Gold auf der Oberfläche befindet. Repräsentative Bilder der Bewegung der Kontroll-, KO8- und KI8-Zellen sind in Abb. 1F dargestellt, während die der Kontroll-, KO9- und KI9-Zellen in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt sind. Die Kontrollzellen erzeugten viel größere Spuren als die KO8-Klone, und das Spurenmuster der KI8-Klone entsprach dem der Kontrollzellen. ImageJ wurde verwendet, um die Fläche der Spuren zu messen, und die Ergebnisse sind in Abb. 1G dargestellt. Der Verlust der α-syn-Expression verringerte die Einzelzellmotilität von KO8 und KO9 signifikant um 69 % (P < 0,0001) bzw. 73 % (P < 0,0001), und die erneute Expression von α-syn stellte die Motilität auf das Niveau von wieder her Kontrollzellen.

Das Invasions- und Migrationspotenzial von SK-MEL-28-Kontroll-, SNCA-KO- und SNCA-KI-Zellen wurde durch Transwell-Assays unter Verwendung von Boyden-Kammern bestimmt39. Der Invasionstest misst die Fähigkeit von Zellen in serumfreien Medien in der oberen Kammer, in das Matrigel einzudringen und sich in die untere Kammer mit vollständigem FBS-haltigem Medium zu bewegen. Der Migrationsassay verwendet den gleichen Aufbau, jedoch ohne Matrigel. Nach 24 Stunden wurden die Zellen in der unteren Kammer fixiert, mit Kristallviolett angefärbt, lichtmikroskopisch abgebildet und gezählt. Repräsentative Bilder aus dem Migrationstest, bei dem Kontrolle, KO8 und KI8 verglichen wurden, sind in Abb. 2A dargestellt. Bilder für Kontrolle, KO9 und KI9 sind in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt. Die Anzahl der migrierten Zellen pro Feld zeigte bei KO8-Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen einen signifikanten Rückgang um 77 % (P < 0,0001), und KI8 zeigte die gleiche Menge an migrierten Zellen pro Feld wie die Kontrollzellen (Abb. 2A, links). Handlung). Ähnliche Ergebnisse wurden für die KO9- und KI9-Klone gefunden (Abb. 2A, rechte Darstellung). Repräsentative Bilder aus dem Invasionstest, bei dem Kontrolle, KO8 und KI8 verglichen wurden, sind in Abb. 2B dargestellt. Bilder für Kontrolle, KO9 und KI9 sind in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt. Die Anzahl der eingedrungenen Zellen pro Feld zeigte bei KO8-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen einen signifikanten Rückgang um 77 % (P < 0,0001), und KI8 zeigte die gleiche Menge an migrierten Zellen wie die Kontrollzellen (Abb. 2B, linke Darstellung). Ähnliche Ergebnisse wurden für die KO9- und KI9-Klone erhalten (Abb. 2B, rechte Darstellung).

SNCA-KO reduziert die Migration und Invasion in SK-MEL-28-Zellen, wie durch einen Transwell-Kammertest ermittelt. Im Migrationsassay wurden 1 × 105 Zellen in serumfreiem Medium in die obere Kammer des Transwell-Geräts (8 μm Poren) gesät und durch die Membran in die untere Kammer wandern gelassen. Im Invasionsassay wurden vor dem Assay 50 µl Matrigel (0,2 mg/ml) zugegeben, um eine dünne Gelschicht zu bilden, und dann wurden 4 × 105 Zellen in serumfreiem Medium in der oberen Kammer ausgesät und konnten durch die Membran eindringen in die untere Kammer. In beiden Experimenten diente DMEM-Komplettmedium mit 50 % FBS in der unteren Kammer als Chemoattraktor. Zellen, die die Membran passierten, wurden mit Paraformaldehyd auf der Membran fixiert und mit Kristallviolett angefärbt. (A) Repräsentative Bilder von migrierten Kontroll-, KO8- und KI8-Zellen (nach 24 h) pro 10-fach-Feld. Aus jeder Innenmembran wurden insgesamt drei mikroskopische Felder zufällig ausgewählt und die Zellen gezählt und in einer Grafik dargestellt (n = 3 unabhängige Experimente). (B) Repräsentative Bilder von eingedrungenen Kontroll-, KO8- und KI8-Zellen (nach 24 h) pro 10-fach-Feld. Aus jeder Innenmembran wurden insgesamt drei mikroskopische Felder zufällig ausgewählt und die Zellen gezählt und in Diagrammen dargestellt (n = 3 unabhängige Experimente). Bei den Werten handelt es sich um Mittelwerte ± SD-P-Werte, die durch einen einfaktoriellen ANOVA-Dunnett-Post-hoc-Test ermittelt wurden.

Als nächstes fragten wir, warum der L1CAM-Spiegel in SNCA-KO-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen signifikant niedriger ist. Wir haben uns auf L1CAM konzentriert, weil (i) L1CAM und α-syn an der synaptischen Plastizität beteiligt sind. (ii) L1CAM wird als Tumorantigen erkannt, das an der Motilität beteiligt ist41,42,43. (iii) L1CAM wird mit TfR1 in 3T3-Fibroblastenzellen endozytiert32. (iv) TfR1-Moleküle werden im Lysosom in SNCA-KO-Zellen effizienter abgebaut als in Kontrollzellen31. Wir stellten die Hypothese auf, dass α-syn den effizienten Transport endozytischer Vesikel, die L1CAM enthalten, zur und von der Plasmamembran fördert; Folglich kann in Abwesenheit von α-syn ein großer Teil der endozytischen Vesikel, die L1CAM-Moleküle enthalten, die Plasmamembran nicht erreichen und wird stattdessen zum Lysosom zum Abbau weitergeleitet. Mindestens vier Wege führen zum Lysosom44,45: (i) Endosom-zu-Lysosom-Weg, (ii) phagozytischer Weg, (iii) Autophagie-zu-Lysosom-Weg (Makroautophagie) und (iv) Chaperon-vermittelte Autophagie. Angesichts des Designs der folgenden Experimente gehen wir davon aus, dass wir den Weg vom Endosom zum Lysosom untersucht haben, obwohl wir auch einen Marker für Autophagie überwacht haben.

Wir haben den Abbau von L1CAM-Molekülen im Lysosom mit dem Inhibitor Bafilomycin A1 (BAF)46 getestet. Baf verhindert die Ansäuerung des Lysosoms, daher sind lysosomale Proteasen, deren Aktivität einen niedrigen pH-Wert erfordert, inaktiv. Vesikel können in Baf-behandelten Zellen immer noch mit Lysosomen verschmelzen, ihre Frachtproteine ​​können jedoch nicht abgebaut werden. Wenn in Abwesenheit einer α-syn-Expression endozytische Vesikel, die L1CAM-Moleküle enthalten, zum Abbau zum Lysosom weitergeleitet werden, sollte Baf diesen Abbau blockieren; Daher sollte der L1CAM-Spiegel in Baf-behandelten SNCA-KO-Zellen derselbe sein wie in Kontrollzellen. Die Zellen wurden 5 Stunden lang mit Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Baf behandelt. Die Zelllysate wurden durch Western Blot auf L1CAM, LC3-I und -II, α-syn und α-Tubulin untersucht (Abb. 3A; ergänzende Abb. S4 und S5). LC3-II, eine lipidierte Form von LC3, reichert sich in Autophagosomen an, wenn die Autophagie gehemmt wird. Die Bandenintensitäten wurden durch Densitometrie quantifiziert und die resultierenden Daten wurden normalisiert und auf zwei Arten analysiert.

Der Verlust von α-syn fördert den lysosomalen Abbau von L1CAM. (A) Western-Blot-Analyse der Spiegel von L1CAM, LC3-I und -II, α-syn und α-Tubulin in Lysaten von Kontroll-, KO- und KI-Zellen, die 5 Stunden lang mit DMSO oder Baf behandelt wurden. Die angegebenen Zellen wurden 5 Stunden lang mit 50 nM Baf behandelt und die Lysate wurden auf die angegebenen Proteine ​​untersucht. Die Bandenintensitäten wurden durch Densitometrie quantifiziert. Dieses Experiment wurde an n = 3 biologischen Replikaten durchgeführt. (B) Diagramm des L1CAM-Spiegels in Lysaten unbehandelter (DMSO) im Vergleich zu behandelten (BAF) Zellen. In diesem Diagramm wurde L1CAM (L1) gemäß (IL1/Itub) auf α-Tubulin (tub) normalisiert, wobei IL1 und Itub die durchschnittlichen Intensitäten der jeweiligen Banden sind. Die P-Werte wurden durch einen einseitigen Student-t-Test ermittelt. (C) Diagramm des L1CAM-Spiegels im Vergleich nach Behandlungsgruppe. In diesem Diagramm wurde L1CAM gemäß der (IL1/Itub)-Probenkontrolle (Itub/IL1) auf α-Tubulin normalisiert. Die P-Werte wurden durch eine einfache ANOVA mit Dunnett-Post-hoc-Test bestimmt. (D) Quantitative RT-PCR-Analyse von L1CAM. Relative mRNA-Spiegel im Fold-Change von L1CAM und SNCA normalisiert auf das Housekeeping-Gen GAPDH. Die P-Werte wurden durch eine einfache ANOVA, Dunnett post hoc (n = 3), bestimmt. Die Werte in den Diagrammen (B–D) sind Mittelwerte ± Standardabweichung

Zunächst verglichen wir den L1CAM-Spiegel in unbehandelten mit behandelten Zellen mithilfe eines einseitigen t-Tests. Eine 5-stündige Baf-Behandlung konnte L1CAM in der Kontrolle und den beiden KI-Klonen nicht erhöhen (Abb. 3B). Im Gegensatz dazu erhöhte die Baf-Behandlung L1CAM um 70 % (P = 0,02) bzw. 47 % (P = 0,14) in KO8- und KO9-Klonen. Diese Ergebnisse zeigen, dass über einen Zeitraum von 5 Stunden eine signifikante Anzahl von L1CAM-Molekülen im Lysosom des KO8-Klons abgebaut wurde, nicht jedoch in Kontrollzellen, KO9- und KI-Klonen.

Zweitens verglichen wir die L1CAM-Spiegel in der unbehandelten Gruppe und separat in der mit Baf behandelten Gruppe. In dieser Analyse wurden die L1CAM-Spiegel in den KO- und KI-Klonen auf Kontrollzellen normalisiert. In der DMSO-Gruppe war die Expression von L1CAM in jedem der SNCA-KO-Klone im Vergleich zu Kontrollzellen um durchschnittlich 50 % (P = 0,022–0,024) verringert (Abb. 3A, Spuren 2 und 4 vs. 1; Abb. 3C). . Im Gegensatz dazu zeigte L1CAM in der Baf-Gruppe keine signifikante Abnahme der KO-Klone im Vergleich zu Kontrollzellen (Abb. 3A, Spuren 8 und 10 vs. 7; Abb. 3C).

Weitere Kontrollexperimente waren wie folgt. Obwohl L1CAM ein Membranprotein ist und Membranproteine ​​im Lysosom abgebaut werden, haben wir mithilfe des Proteasom-Inhibitors MG132 bestätigt, dass L1CAM keinem proteasomalen Abbau unterliegt (ergänzende Abbildung S6). Wir führten auch eine quantitative PCR (qPCR) durch, um den Gehalt an L1CAM-mRNA in Kontroll- und KO-Klonen zu überprüfen. Es wurden keine Hinweise auf eine Abnahme der L1CAM-mRNA in KO8- und KO9-Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen gefunden. Stattdessen wurde ein geringfügiger Anstieg dieses Transkripts in den KO-Klonen festgestellt (Abb. 3D). Die kombinierten Ergebnisse stimmen mit einer Abnahme des L1CAM-Spiegels in den SNCA-KO-Zellen aufgrund des Abbaus des Proteins im Lysosom überein.

Wir haben SNCA in der menschlichen Hautzelllinie SK-MEL-29 ausgeschaltet und die Elternzellen und zwei SNCA-KO-Klone (Tabelle 1) in den folgenden Experimenten verwendet. Western Blot wurde verwendet, um die Expression von L1CAM, N-Cadherin, Vimentin, α-Syn und α-Tubulin in Zellextrakten zu untersuchen (Abb. 4A, B; ergänzende Abb. S7, nicht beschnittene Blots). Der Verlust der α-syn-Expression verursachte eine 20 %ige Abnahme der Expression von L1CAM in beiden SNCA-KO-Klonen im Vergleich zu Kontrollzellen (Abb. 4A, C), eine 20 %ige Abnahme von N-Cadherin (Abb. 4A, D), aber keine Veränderung bei Vimentin (Abb. 4B, E). Obwohl die Abnahmen der L1CAM- und N-Cadherin-Expression moderat waren, waren drei der vier Veränderungen statistisch signifikant. Wir führten auch den Einzelzellmotilitätstest mit kolloidalem Gold an SK-MEL-29-Elternzellen und zwei SNCA-KO-Klonen durch. Die Kontrollzellen hatten eine viel größere Beweglichkeit als jeder der beiden KO-Klone, und Bilder der Spuren für Kontrolle und KO1 sind in Abb. 4 F dargestellt, und die Spuren für KO2 sind in der ergänzenden Abbildung S7 dargestellt. Die Darstellung der quantifizierten Fläche einzelner Zellspuren zeigte eine 80-prozentige Abnahme der Motilität (P <0,0001) für jeden KO-Klon (Abb. 4G).

Der Verlust von α-syn verringert L1CAM und N-Cadherin sowie die Motilität in SK-MEL-29-Zellen. (A) Repräsentative Western Blots von L1CAM, N-Cad, α-syn und α-Tubulin in Lysaten der in vitro kultivierten Kontroll- und α-syn-KO-Zellen. (B) Repräsentative Western Blots von Vimentin, α-Syn und α-Tubulin. Quantitative Daten, die die relativen Proteinspiegel von L1CAM (C), N-Cad (D) und Vimentin (E) zeigen, normalisiert auf α-Tubulin. Alle Experimente wurden mit mindestens drei biologischen Replikaten wiederholt (n = 3). (F) Repräsentative Hellfeldmikroskopbilder von phagokinetischen Spuren, die von Kontroll- und KO-α-syn-Zellen auf kolloidalen goldbeschichteten Vertiefungen erzeugt wurden, wurden mit einem Lichtmikroskop mit einem ×10-Objektiv aufgenommen. Die einzelnen phagokinetischen Spuren, die durch schwarze Pfeilmarkierungen dargestellt werden, wurden mit der ImageJ-Software gemessen und in (G) dargestellt. Mindestens 33 Spuren pro Versuchsbedingung wurden zufällig zur Quantifizierung ausgewählt. Für die statistische Analyse wurden insgesamt 100 Spuren für n = 3 pro Versuchsgruppe verwendet. Die Werte in den Diagrammen (C–E, G) sind Mittelwerte ± Standardabweichung. Die P-Werte wurden durch einen einfaktoriellen ANOVA-Dunnett-Post-hoc-Test bestimmt.

Angesichts der Tatsache, dass der Verlust der α-syn-Expression die L1CAM-, N-Cadherin- und Zellmotilität in zwei Melanomzelllinien verringert, fragten wir, ob das Gegenteil der Fall wäre: Erhöht die Expression von α-syn in Zellen, denen die α-syn-Expression fehlt, die Expression von? proonkogene Adhäsionsproteine ​​und erhöhen gleichzeitig die Zellmotilität? Um diese Idee zu testen, verwendeten wir die menschliche Neuroblastomzelllinie SH-SY5Y, die kein nachweisbares α-syn aufweist, und SH-SY5Y-Zellen (SH/+αS), die Wildtyp-α-syn stabil exprimieren (Tabelle 1). Die L1CAM-, N-Cadherin-, Vimentin-, α-syn- und GAPDH-Spiegel in den Zellextrakten wurden durch Western Blot untersucht (Abb. 5A; ergänzende Abb. S8, nicht zugeschnittene Blots), was zu den folgenden Ergebnissen führte. Erstens wurde α-syn in den SH/+αS-Zellen stark exprimiert, jedoch nicht in der Elternlinie (Abb. 5A, Tafel 4). Zweitens war der L1CAM-Spiegel in den SH/+αS-Zellen um 54 % (P = 0,044) höher als in den Elternzellen (Abb. 5A, Tafel 1; Abb. 5B). Drittens waren die N-Cadherin-Spiegel in den beiden Zelllinien ähnlich (P = 0,508) (Abb. 5A, Tafel 3; Abb. 5B). Viertens war der Vimentinspiegel in den SH/+αS-Zellen um 415 % (P = 0,001) höher als in den Elternzellen (Abb. 5A, Tafel 2; Abb. 5C).

Die Expression von α-syn in SH-SY5Y-Zellen erhöht L1CAM und Motilität. (A) Repräsentative Western Blots von L1CAM, Vimentin, N-Cad, α-syn und α-Tubulin in Lysaten von Kontroll- und SH/αS-Zellen, die in vitro kultiviert wurden. Quantitative Analysen, die die relativen Proteinspiegel darstellen, wurden durch Normalisierung der Bandenintensitäten von L1CAM und N-Cad (B) und Vimentin (C) auf α-Tubulin gemessen. Alle Experimente wurden mit mindestens drei biologischen Replikaten wiederholt (n = 3–6). (D) Repräsentative Hellfeldmikroskopbilder von phagokinetischen Spuren, die durch Kontroll- und α-syn-überexprimierende SH-SY5Y-Zellen auf kolloidalen goldbeschichteten Vertiefungen erzeugt wurden. Die Bilder wurden mit einem Lichtmikroskop mit einem ×10-Objektiv aufgenommen. Die einzelnen phagokinetischen Spuren, die durch schwarze Pfeilmarkierungen dargestellt werden, wurden mit der ImageJ-Software gemessen und in (E) dargestellt. Mindestens 33 Spuren pro Versuchsbedingung wurden zur Quantifizierung zufällig ausgewählt. Für die statistische Analyse wurden insgesamt 100 Spuren für n = 3 pro Versuchsgruppe verwendet. Die Werte in den Diagrammen (B, C, E) sind Mittelwerte ± Standardabweichung. Die P-Werte wurden durch einen zweiseitigen Student-t-Test ermittelt.

Die Einzelzellmotilität der beiden SH-SY5Y-Zelllinien wurde ebenfalls gemessen. SH/+αS-Zellen zeigten während der 24-stündigen Inkubationszeit im Vergleich zu den Elternzellen eine robuste Einzelzellmotilität (Abb. 5D). Die Darstellung der quantifizierten Fläche einzelner Zellspuren zeigt, dass die Expression von α-syn in den SH-SY5Y-Zellen die Einzelzellmotilität dieser Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen signifikant erhöhte. Bemerkenswerterweise zeigten die SH/+αS-Zellen im Vergleich zu den Elternzellen einen Anstieg der Einzelzellmotilität um 597 % (P < 0,0001) (Abb. 5E).

Vor 40 Jahren durchgeführte klassische Experimente lieferten einen hervorragenden Bericht über die Kinetik der Internalisierung von Transferrin und des Transferrinrezeptors in einer menschlichen Hepatomzelllinie 47,48. Eine dieser Gruppen schlug sogar ein Modell für die Internalisierung und das Recycling vor, das einen Standardweg zum Lysosom aufweist48. Ihr Modell ist ein hervorragendes Modell für die vorliegende Arbeit (siehe Abb. 7 von Lit. 48). Wir wissen jetzt, dass TfR und L1CAM jeweils eine zytosolische Endozytose-Recycling-Sequenz haben 32,49, beide an AP-2 binden, ein Clathrin-Adapterprotein, das an die Recycling-Sequenz bindet, beide eine Clathrin-vermittelte Endozytose durchlaufen 32,50, und sie kolokalisieren während der Clathrin-vermittelten Internalisierung32, wie im Modell in Abb. 6A erfasst.

Vorgeschlagenes Modell und Simulationen der Wirkung von α-syn auf das Rezeptorrecycling. (A) Linkes Feld: Modell, bei dem α-syn den Transport internalisierter Vesikel, die L1CAM und TfR enthalten, zur Plasmamembran beschleunigt. Rechtes Feld: Modell, bei dem der Verlust der α-syn-Expression zu weniger L1CAM und TfR auf der Plasmamembran führt. (B) Vorgeschlagene Reaktionen, die den Vesikelhandel modellieren. Ro, Ri und Rlys sind Rezeptormoleküle auf der Zelloberfläche, in einem internalisierten Vesikel bzw. im Lysosom. α-syn kann diese drei Reaktionen unterschiedlich beeinflussen. Siehe Simulationsergebnisse in der Datei „Supplementary Simulations“. (C) Das Diagramm zeigt den Prozentsatz von Ro und Rlys nach 180 Minuten Simulation für die folgenden Reaktionen. +α-syn-Fall: k1 = 0,1 min−1, k−1 = 0,5 min−1, k2 = 0,005 min−1. −α-syn-Fall: k1 = 0,1 min−1, k−1 = 0,1 min−1, k2 = 0,005 min−1. (D) Das Diagramm zeigt den Prozentsatz von Ro und Rlys nach 180 Minuten Simulation für die folgenden Reaktionen. + α-syn-Fall: k1 = 0,1 min−1, k−1 = 0,5 min−1, k2 = 0,005 min−1. −α-syn-Fall: k1 = 0,1 min−1, k−1 = 0,5 min−1, k2 = 0,02 min−1.

Wir versuchten zu verstehen, wie sich α-syn auf den Rezeptorhandel auswirkt, indem wir Simulationen durchführten. Basierend auf dieser früheren Arbeit zum TfR-Handel sind die beiden Reaktionen (ebenfalls in Abb. 6B dargestellt) das einfachste Modell für die Abnahme von L1CAM und TfR in SNCA-KO-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen.

Dabei sind Ro, Ri und Rlys der plasmamembrangebundene Rezeptor, der internalisierte Rezeptor in Vesikeln bzw. der Rezeptor im Lysosom. Wir schlagen vor, dass Gl. (1) kann durch die Reaktion kleiner Moleküle in Lösung nach modelliert werden

Espenson51 löste die Differentialgleichungen, die mit den Reaktionen in Gl. verbunden sind. (2) und wir haben diese Lösungen verwendet, um die Rolle von α-syn beim Rezeptorhandel in zwei Simulationen zu untersuchen (Einzelheiten siehe „Materialien und Methoden“), wie folgt.

Wir haben festgestellt, dass α-syn die Fusion internalisierter Vesikel mit der Plasmamembran (Ri → Ro) stärker beschleunigt als die Endozytose (Ro → Ri), dh k-1 > k1. Dies wäre eine naheliegende Möglichkeit, die Anzahl der Rezeptoren auf der Zelloberfläche zu erhöhen oder aufrechtzuerhalten. In diesem Modell würde ein Verlust der α-syn-Expression daher die Geschwindigkeit verringern, mit der internalisierte Vesikel mit der Plasmamembran verschmelzen. Um diese vorgeschlagene katalytische Wirkung von α-syn zu simulieren, wurde eine Simulation mit k-1 = 0,5 min−1 und k1 = 0,1 min−1 durchgeführt; wohingegen die andere Simulation, bei der die α-syn-Expression fehlt, mit k−1 = k1 = 0,1 min−1 durchgeführt wurde (in jeder dieser Simulationen k2 = 0,005 min−1). Diese Simulationen ergaben, dass der Verlust von α-syn die Anzahl der Rezeptoren auf der Zelloberfläche verringert (72 % → 33 %) und die Anzahl im Lysosom erhöht (14 % → 35 %) (Abb. 6C).

Wir haben festgestellt, dass α-syn den Transfer internalisierter Vesikel in das Lysosom (Ri → Rlys) hemmt. Daraus folgt, dass ein Verlust der α-syn-Expression daher die Geschwindigkeit erhöhen würde, mit der internalisierte Vesikel in das Lysosom übertragen werden. Um die vorgeschlagene Hemmwirkung von α-syn zu simulieren, wurde eine Simulation mit k2 = 0,005 min−1 durchgeführt; wohingegen die andere Simulation, bei der die α-syn-Expression fehlt, mit k2 = 0,02 min−1 durchgeführt wurde (in jeder dieser Simulationen war k−1 = 0,5 min−1 und k1 = 0,1 min−1). Diese Simulationen zeigen, dass der Verlust von α-syn die Anzahl der Rezeptoren auf der Zelloberfläche verringert (72 % → 47 %) und die Anzahl der auf das Lysosom übertragenen Rezeptoren erhöht (14 % → 44 %) (Abb. 6D). Insgesamt zeigen unsere Simulationen, dass α-syn die Anzahl der L1CAM- und/oder TfR-Moleküle auf der Zelloberfläche auf zwei sehr unterschiedliche Arten verändern kann.

Die wichtigsten Erkenntnisse in diesem Bericht sind, dass (i) der Verlust der α-syn-Expression in zwei humanen kutanen Melanomzelllinien L1CAM, N-Cadherin und die Zellmotilität signifikant verringert (Abb. 1B, C, E, 4A, C, G). ). (ii) Der Verlust der α-syn-Expression stimuliert den Abbau von L1CAM im Lysosom (Abb. 3). (iii) Eine Erhöhung der α-syn-Expression in SH-SY5Y-Zellen erhöht L1CAM und die Zellmotilität (Abb. 5A, B, D, E).

L1CAM ist ein 200–220 kDa großes Transmembran-Glykoprotein, das zur Immunglobulin-Superfamilie gehört und im erwachsenen Nervensystem eine Vielzahl von Aktivitäten ausübt, darunter Neuritenwachstum, Migration, Adhäsion und neuronale Differenzierung (Übersichten siehe 52,53,54). . L1CAM ist an der synaptischen Plastizität beteiligt (52), und seltsamerweise ist α-syn an der synaptischen Plastizität (40) beteiligt. L1CAM, das bei mehreren Krebsarten neuroektodermalen Ursprungs und der Neuralleiste55, einschließlich Melanomen, hochreguliert ist, gilt als Tumorantigen, das an der Motilität beteiligt ist41,42,43. Ernst et al. fanden heraus, dass der Abbau von L1CAM die Metastasierung in einem Xenotransplantatmodell eines menschlichen Melanoms deutlich reduziert56. Hier haben wir herausgefunden, dass das Ausschalten von SNCA den L1CAM-Spiegel im Vergleich zu Kontrollzellen, die α-syn exprimieren, signifikant verringert, und der verringerte Spiegel dieses Adhäsionsproteins trägt wahrscheinlich zur Verringerung der Zellmotilität in zwei Melanomzelllinien und einer Neuroblastomzelle bei Linie.

Die Simulationen zeigen, dass α-syn die Menge an L1CAM und/oder TfR auf der Zelloberfläche erhöhen (oder aufrechterhalten) kann, indem es entweder den Transport oder die Fusion von Vesikeln mit der Plasmamembran fördert oder die Fusion internalisierter Vesikel mit dem Lysosom hemmt (Abb . 6). Es ist theoretisch möglich, dass α-syn die Menge an L1CAM und TfR auf der Zelloberfläche durch Hemmung der Endozytose erhöhen (oder aufrechterhalten) könnte. Angesichts der Tatsache, dass Synuklein nachweislich die Endozytose fördert26, lehnten wir die Idee ab, dass Synuclein durch Hemmung der Endozytose wirken würde. Offensichtlich sind hochauflösende Mikroskopieexperimente von markiertem TfR oder markiertem L1CAM in Zellen mit und ohne α-syn-Expression erforderlich, um die spezifische Reaktion oder die spezifischen Reaktionen zu entschlüsseln, die durch α-syn beeinflusst werden.

Turriani und Kollegen29 schlugen kürzlich vor, dass „es einen umgekehrten molekularen Zusammenhang zwischen PD und Melanom gibt und dass Proteine, die „schädliche Akteure“ bei Parkinson sind, „nützliche Akteure“ bei Melanomen sind, weil ihre Funktionen primären und metastasierten Melanomen erhebliche Überlebensvorteile verleihen.“ Turriani zeigte, dass die Verbindung anle128b, die die Prion-ähnlichen Oligomere von α-syn29 zerstört, Neuronen vor dem durch α-syn verursachten Zelltod schützt. Im Gegensatz dazu fördert diese Verbindung jedoch den massiven Zelltod der Melanomzelllinie WM983-B. Die Behandlung von WM983-B-Zellen mit anle138b führte zu verringerten Mengen an aggregiertem α-syn, morphologischen Veränderungen und Störungen des mitochondrialen Membranpotentials und der Autophagie. Man kam zu dem Schluss, dass die Auflösung aggregierter, prionähnlicher Formen von α-syn die Autophagie fehlreguliert, was darauf hindeutet, dass diese ungewöhnlichen, aggregierten Formen von α-syn die Autophagie fördern. Unsere Studie und die Turriani-Studie unterscheiden sich erheblich, da Turriani Melanomzellen, die aggregierte, prionartige Formen von α-syn enthielten, mit denselben Zellen verglich, in denen die Aggregate aufgelöst waren; wohingegen wir Melanomzellen, die α-syn exprimieren, mit solchen verglichen, die dies nicht tun. Andererseits konvergierte jede Studie unabhängig voneinander in Bezug auf das endolysosomale System, dh wie Synuclein die Lysosomenaktivität und den endolysosomalen Transport beeinflusst. Es sind weitere Arbeiten erforderlich, um die Rolle von α-syn beim Melanom zu entschlüsseln.

E- und N-Cadherin sind Ca++-abhängige Zell-Zell-Adhäsions-Transmembran-Glykoproteine57. Die konservierten zytoplasmatischen Schwänze dieser beiden Proteine ​​interagieren mit Netzwerken von Proteinen, die an verschiedenen Zellsignalwegen beteiligt sind. Die Ektodomäne von E-Cadherin bildet mit benachbarten Zellen homotypische Dimere. N-Cadherin hat eine ähnliche Struktur wie E-Cadherin, sein zytoplasmatischer Schwanz interagiert jedoch mit einem anderen Satz von Proteinen58. Eines der Kennzeichen der EMT ist die Hochregulierung von N-Cadherin, gefolgt von der Herunterregulierung von E-Cadherin58. In unseren Händen verringerte das Ausschalten der α-syn-Expression in den beiden Melanomzelllinien den N-Cadherin-Spiegel signifikant, nicht jedoch den E-Cadherin-Spiegel (Abb. 1A, C, E, 4A, C, D). Es ist, als würde der Verlust der α-syn-Expression ein „EMT-ähnliches“ Phänomen teilweise umkehren.

Kürzlich wurden renale tubuläre Epithelzellen, bedingte Knockout-Mäuse und klinische Proben von menschlichem Nierengewebe verwendet, um die Rolle von renalem tubulärem Epithel-α-syn bei Nierenfibrose zu beurteilen59. Bozic und Kollegen fanden heraus, dass die Behandlung von HK-2-Nierenzellen mit dem transformierenden Wachstumsfaktor Beta 1 (TGF-β1), der die Fibrose-Signalisierung in Nierenepithelzellen vermittelt, den epithelialen Phänotyp veränderte (Verlust der Cobblestone-Morphologie), E-Cadherin verringerte und erhöhte Alpha-Glattmuskel-Aktin (α-SMA) und Vimentin. TGF-β1 induzierte gleichzeitig eine dosisabhängige Abnahme der SNCA-mRNA- und α-syn-Expression. Angesichts des gleichzeitigen Auftretens des Verlusts des epithelialen Phänotyps und der Dysregulation der α-syn-Expression stellten die Autoren die Hypothese auf, dass α-syn eine Rolle bei der Aufrechterhaltung des epithelialen Phänotyps renaler proximaler tubulärer Epithelzellen (RPTECs) in vitro spielt. Ihre Hypothese wurde durch ihre Entdeckung gestützt, dass eine Überexpression von α-syn in HK-2-Zellen den TGF-β1-induzierten Anstieg von α-SMA und Vimentin in vitro hemmte. Sie zeigten weiterhin, dass α-syn die Aktivierung von ERK1/2, Akt und p38 in vitro moduliert, dass TGF-β1 die α-syn-Expression über die Aktivierung der MAPK-p38-Achse verringert und dass der Verlust von α-syn das profibrotische Gen beschleunigt Ausdruck. Unsere Gruppe hatte zuvor gezeigt, dass α-syn die stressinduzierte Phosphorylierung von p38 (und JNK und c-Jun) in SH-SY5Y-Zellen60 hemmt. Ihre Schlussfolgerung war, dass α-syn eine Rolle bei der Aufrechterhaltung des epithelialen Phänotyps von RPTECs spielt. Natürlich ist es schwierig, unsere Ergebnisse mit denen von Bozic zu vergleichen, da wir nicht aus dem Epithel stammende Krebszellen verwendeten, während Bozic sich nicht teilende Nierenepithelzellen verwendete. Andererseits offenbaren diese beiden Studien die Dr. Jekyll- und Mr. Hyde-ähnliche Natur von α-syn: α-syn unterstützt einen epithelialen Phänotyp von Nierenzellen, wohingegen es einen „mesenchymalen“ Phänotyp von Melanomen und Neuroblastomen unterstützt Zellen.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass der Verlust der α-syn-Expression in zwei humanen kutanen Melanomzelllinien zu einer signifikanten Abnahme der beiden Adhäsionsproteine ​​L1CAM und N-Cadherin und damit einhergehend zu einer signifikanten Abnahme der Motilität führt. Wir schlagen vor, dass α-syn das Überleben von Melanomen (und wahrscheinlich auch Neuroblastomen) fördert, da es den effizienten vesikulären Transport von L1CAM zur Plasmamembran fördert, was wiederum die Invasion, Migration und Motilität fördert.

SK-MEL-28- und SK-MEL-29-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) bzw. vom Sloan-Kettering Memorial Center erworben und in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), vermehrt. und 1 % Penicillin-Streptomycin. Die menschliche Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y, die α-syn (SH/αS) überexprimiert, und die Kontroll-SH-SY5Y-Zellen waren ein freundliches Geschenk von Dr. Joseph R. Mazzulli (Northwestern University) und wurden in Opti-MEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rind, vermehrt Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin. CRISPR/Cas9-Genomeditierung wurde verwendet, um SNCA in SK-MEL-29-Zellen anzugreifen, wie zuvor31 für SK-MEL-28-Zellen unter Verwendung des α-syn-CRISPR/Cas9-Knockout-Plasmids (Santa Cruz Biotechnology # sc-417273-NIC) beschrieben. Lentivirus-Partikel, die menschliches α-syn unter dem Cytomegalovirus (CMV)-Promotor (Applied Biological Materials, Inc, Kanada) exprimieren, wurden verwendet, um α-syn in SK-MEL-28-KO-Zellen wie zuvor beschrieben erneut zu exprimieren31. Für Proteasom- und Autophagie-Hemmungsexperimente wurden die Zellen 6 Stunden lang mit 10 µM MG132 (Thermofisher Scientific, # M7449) und 5 Stunden lang mit 50 nM Bafilomycin A1 (Millipore, # B1793) in Wachstumsmedium behandelt. Die Zelllinien wurden mit dem MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit (# LT07-318) authentifiziert und auf Mykoplasmenkontamination getestet.

Die Vorbereitung der Zelllysate, die SDS/PAGE und die Western-Blot-Analyse wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt31. Kurz gesagt, die Zellen wurden in RIPA-Lysepuffer (50 mM Tris HCl, pH 7,4, 1 % NP-40, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS, 5 mM EDTA) lysiert. Die Lysate wurden zentrifugiert (13.000 U/min/30 Min./4 °C) und die Proteinkonzentrationen der Überstände wurden mit dem DC™ Protein Assay Kit (Bio-Rad #5 000 112) bestimmt. Proben mit gleichen Proteinkonzentrationen (30 μg) wurden mit Dithiothreitol (Invitrogen™ NuPAGE™ Sample Reducing Agent # NP0004) behandelt und 10 Minuten lang bei 70 °C in NuPAGE™ LDS Sample Buffer (#NP000) gekocht. Die Proteine ​​wurden durch Natriumdodecylsulfat-Bis-Tris-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (NuPAGE™ 4 bis 12 %, vorgefertigtes Bis-Tris-Polyacrylamidgel, Invitrogen # NP0323BOX) aufgetrennt und anschließend unter Verwendung von (Trans -Blot® Turbo™ Mini PVDF Transfer Pack, Bio-Rad # 1704156). Nach dem Blockieren der Membranen mit 5 % Blotto (G-Biosciences Blot-Quikblocker Nr. 786-011) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % (v/v) Tween-20 (PBST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Membranen oft blockiert In Streifen geschnitten und die einzelnen Streifen wurden mit den angegebenen Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C hybridisiert, gefolgt von einer Inkubation mit entsprechenden Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Konjugaten. Die immunreaktiven Banden wurden mithilfe eines verstärkten Chemilumineszenzsubstrats (Clarity™ Western ECL Substrate, Bio-Rad Nr. 170-5060) sichtbar gemacht und die Bilder wurden mit dem Biorad Chemidoc-MP-Bildgebungssystem aufgenommen. Die Bandenintensitäten der interessierenden Proteine ​​wurden quantifiziert und als relative Proteinspiegel, normalisiert auf das Haushaltsprotein α-Tubulin, mithilfe der ImageJ-Software dargestellt. Antikörper (mit Verdünnungen) sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Das Invasions- und Metastasierungspotenzial der Zelllinien in Tabelle 1 wurde durch Transwell-Assays unter Verwendung von Boyden-Kammern mit einer Porengröße von 8 μm (Costar; Corning, Inc. # CL3464) bestimmt. Kurz gesagt, die Zellen wurden in serumfreiem DMEM suspendiert und mit (Invasionsassay) und ohne (Migrationsassay) Matrigel (Corning, Inc. Nr. 356234) auf die apikale Kammer ausgesät, und 750 μl Komplettmedium mit 10 % FBS wurden hinzugefügt 24 Stunden lang in die untere Kammer des Transwells gegeben. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C wanderten/drangen die Zellen durch die untere Oberfläche ein und wurden 5 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann 10 Minuten lang mit 0,1 % Kristallviolett gefärbt, um die Visualisierung der Zellen zu ermöglichen. Die Zellen in der oberen Kammer des Transwells wurden vorsichtig mit einem Wattestäbchen entfernt und die Bilder der Zellen in der unteren Kammer des Transwells wurden mit einem umgekehrten Lichtmikroskop von Olympus aufgenommen.

Die Beweglichkeit der Kontroll- und SNCA-KO-Melanomzelllinien wurde gemessen, indem die Fähigkeit der Zellen verfolgt wurde, Gold aus ihrem Weg zu entfernen38. Hierzu wurden Platten mit sechs Vertiefungen mit 2 ml 1 % BSA beschichtet, 3 Stunden lang in einem befeuchteten CO2-Inkubator bei 37 °C inkubiert und mit absolutem Ethanol gewaschen. Die Vertiefungen wurden dann mit einer homogenen Schicht kolloidaler Goldlösung beschichtet, die wie folgt zubereitet wurde: Insgesamt 3,85 ml steriles H2O, 630 µL 14,5 mM AuHCl4 und 2,1 ml 36,5 mM Na2CO3, gefolgt von Kochen bei 100 °C 5 min und Zugabe von 0,1 % Formaldehyd. Die mit kolloidalem Gold beschichteten Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C in einem CO2-Inkubator inkubiert und die Zellen wurden mit einer Endzahl von 1 × 103 Zellen pro Vertiefung in einem Vollmedium mit 10 % FBS ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die Vertiefungen mit einem Olympus-Umkehrlichtmikroskop abgebildet und die Spuren mit der ImageJ-Software quantifiziert.

Die Gesamt-RNA wurde aus den Zellen unter Verwendung des EZNA-Säulen-Gesamt-RNA-Kits (Omega BioTek) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die Konzentration und Qualität der extrahierten RNA wurden mit einem NanoDrop-Spektrophotometer (Thermo Scientific) bestimmt. Die cDNA wurde aus der gesamten gereinigten RNA (1 μg) jeder Probe unter Verwendung des iScript cDNA-Synthesekits (Bio-Rad) gemäß dem Protokoll des Herstellers synthetisiert. qPCR wurde unter Verwendung von Applied Biosystems TaqMan™ Gene Expression Assays mit Primer-/Sondensätzen für SNCA (Hs00240906), L1CAM (Hs01109748) und GAPDH (Hs02786624) durchgeführt. Die ΔΔCT-Methode wurde angewendet, um die relative Menge jeder auf das Housekeeping-Gen GAPDH normalisierten mRNA zu berechnen. Die Daten wurden mit der Vergleichs-CT-Methode analysiert und die Faltungsänderung wurde mit der 2−ΔΔCT-Methode unter Verwendung des Bio-Rad CFX384 Touch Real-Time PCR-Systems und der Software (Bio-Rad) berechnet. Die Ergebnisse wurden entweder als relative log2-FC-Werte (Fold Change) ausgedrückt.

Espenson51 löste die Differentialgleichungen, die mit den Reaktionen in Gl. verbunden sind. (2) für den Sonderfall [A](t = 0) = [A]o und [B]o = [C]o = 0. Die Lösungen für die drei Arten sind

wobei λ2 = ½ (p + q) und λ3 = ½(p − q) mit p = k1 + k−1 + k2 und q = (p2 – 4 k1k2)1/2. Wir haben die Gleichungen verwendet. (3), (4) und (5), um die Werte von [Ro](t), [Ri](t) bzw. [Rlys](t) zu bestimmen.

Die Simulationen wurden wie folgt durchgeführt. (i) Gl. (3), (4) und (5) wurden in eine Excel-Datei eingegeben (siehe Supplementary Simulations.xls). (ii) Werte für die Geschwindigkeitskonstanten k1, k−1 und k2 wurden ausgewählt. (iii) Bei t = 0 befanden sich alle Rezeptoren auf der Plasmamembran [Ro] = 1,0 μM und [Ri] = [Rlys] = 0. (iv) Die Simulationen dauerten 180 Minuten. (v) Während der Simulation fand keine Proteinsynthese statt. (vi) Die Grundlage für diese Simulationen war, dass α-syn durch seine Fähigkeit, an Membranen zu binden, die Größe jeder der drei Geschwindigkeitskonstanten beeinflussen kann. Die Werte von [Ro](t = 180 min) und [Rlys](t = 180 min) sind in Abb. 6C, D dargestellt. [Rlys](t = 180 min)-Werte sind aufgrund der Rezeptoren mit negativem Vorzeichen dargestellt werden beim Eintritt in das Lysosom abgebaut.

Zu den Hypothesentestmethoden gehörten eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA) mit einem Dunnett-Post-hoc-Test beim Vergleich mehrerer Gruppen mit der Kontrolle (Abb. 1 E, G, 2, 3C, D und 4C–E, G), ein Zweier -seitiger Student-t-Test beim Vergleich zweier Gruppen (Abb. 5 B, C, E) und ein einseitiger Student-t-Test beim Vergleich von DMSO mit Baf-behandelten Proben (Abb. 3B). Alle Daten wurden mit der Software GraphPad Prism (Version 6) analysiert. Alle Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von mindestens drei unabhängigen Experimenten (biologische Replikate) ausgedrückt. Ein P-Wert von < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Alle Daten aus dieser Studie sind im Artikel und seinen Zusatzinformationen enthalten.

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Diese Studie wurde durch Mittel des Feist-Weiller Cancer Center und des Chancellor of LSU Health Sciences Center in Shreveport an SNW unterstützt

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Nithya Gajendran und Santhanasabapathy Rajasekaran.

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Louisiana State University Health Sciences Center, Shreveport, USA

Nithya Gajendran, Santhanasabapathy Rajasekaran und Stephan N. Witt

Feist-Weiller Cancer Center, Louisiana State University Health Shreveport, Shreveport, USA

Stephan N. Witt

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NG und SR trugen gleichermaßen zur Konzeption, Experimentierung, Datenanalyse, Interpretation und Überarbeitung der Studie bei. SNW war an der Konzeption der Studie beteiligt, überwachte die Studie und Datenanalyse und verfasste und redigierte das Manuskript. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Stephan N. Witt.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Gajendran, N., Rajasekaran, S. & Witt, SN Das Ausschalten von Alpha-Synuclein in Melanomzellen reguliert L1CAM herunter und verringert die Motilität. Sci Rep 13, 9243 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36451-3

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Eingegangen: 16. Januar 2023

Angenommen: 03. Juni 2023

Veröffentlicht: 07. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36451-3

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