Effluxpumpen-Genamplifikationen umgehen die Notwendigkeit mehrerer Zielmutationen für die Resistenz gegen Dual

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3402 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Antibiotika, die mehrere zelluläre Ziele haben, verringern theoretisch die Häufigkeit der Resistenzentwicklung, adaptive Verläufe und Resistenzmechanismen gegen solche Antibiotika sind jedoch wenig erforscht. Hier untersuchen wir diese bei Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus (MRSA) mithilfe experimenteller Evolution bei Exposition gegenüber Delafloxacin (DLX), einem neuartigen Fluorchinolon, das sowohl auf DNA-Gyrase als auch auf Topoisomerase IV abzielt. Wir zeigen, dass die Selektion auf kodierende Sequenzmutationen und genomische Amplifikationen des Gens, das für eine schlecht charakterisierte Effluxpumpe, SdrM, kodiert, zu einer hohen DLX-Resistenz führt, wodurch die Notwendigkeit von Mutationen in beiden Zielenzymen umgangen wird. In den entwickelten Populationen führt die Überexpression von sdrM aufgrund genomischer Amplifikationen, die sdrM und zwei benachbarte Gene enthalten, die für Effluxpumpen kodieren, zu einer hohen DLX-Resistenz, während die angrenzenden per Anhalter fahrenden Effluxpumpen zur Streptomycin-Kreuzresistenz beitragen. Darüber hinaus erfordert das Fehlen von sdrM Mutationen in beiden Zielenzymen, um eine DLX-Resistenz zu entwickeln, und sdrM erhöht somit die Häufigkeit der Resistenzentwicklung. Schließlich werden sdrM-Mutationen und -Amplifikationen auf ähnliche Weise in zwei verschiedenen klinischen Isolaten ausgewählt, was auf die Allgemeingültigkeit dieses DLX-Resistenzmechanismus hinweist. Unsere Studie zeigt, dass die Entwicklung von Resistenzen gegen Multi-Targeting-Antibiotika statt reduzierter Resistenzraten alternative hochfrequente Evolutionspfade umfassen kann, die zu unerwarteten Veränderungen der Fitnesslandschaft, einschließlich Antibiotika-Kreuzresistenzen, führen können.

Die Entstehung antimikrobieller Resistenzen (AMR) stellt eine große Bedrohung für die globale Gesundheit dar. Ein aktueller Bericht weist darauf hin, dass es im Jahr 2019 weltweit möglicherweise mehr als eine Million Todesfälle aufgrund von AMR gegeben hat1. Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) verursacht eine Vielzahl von Infektionen im Gesundheitswesen und in der Gemeinde mit hohen Inzidenz- und Mortalitätsraten. und kann Resistenzen gegen die meisten verfügbaren Antibiotika entwickeln2,3,4,5,6,7. Resistenzdeterminanten in Bakterien werden typischerweise entweder durch horizontalen Gentransfer oder De-novo-Mutationen erworben. Zu den Mechanismen gehören der Abbau oder die Sequestrierung von Antibiotika, die Modifikation von Zielkomponenten und die Überproduktion von Effluxpumpen8,9,10,11. Darüber hinaus können allgegenwärtige und instabile genomische Duplikationen und Amplifikationen zu einer erhöhten Expression modifizierender Enzyme und Effluxpumpen führen, die dann eine Antibiotikaresistenz verleihen und bei Antibiotikaexposition selektiert werden können12,13,14.

Eine vorgeschlagene Strategie zur Verringerung des Anstiegs der Antibiotikaresistenz besteht darin, Antibiotika mit mehr als einem Ziel zu entwickeln und so die Häufigkeit der Resistenzentwicklung zu verringern15,16. Jüngste Studien haben zwei solcher Dual-Targeting-Antibiotika identifiziert, die sowohl auf die Membranintegrität als auch auf einen zusätzlichen Zellweg abzielen und bisher das Auftreten von Resistenzen im Labor vermieden haben17,18,19. Die bakteriellen Topoisomerasen DNA-Gyrase und Topoisomerase IV wurden ebenfalls als potenzielle Angriffspunkte für Antibiotika mit doppelter Wirkungsrichtung vorgeschlagen, und es wurde gezeigt, dass der Angriff auf beide Enzyme die Resistenzentwicklung hemmen und möglicherweise neue Resistenzdeterminanten involvieren kann15,16,20,21 . Die Mechanismen der Resistenzentwicklung gegen solche Multi-Targeting-Antibiotika und die zugrunde liegenden Anpassungsverläufe wurden jedoch nicht charakterisiert.

Fluorchinolone sind eine weit verbreitete Klasse von Antibiotika, und die meisten herkömmlichen Fluorchinolone wie Ciprofloxacin und Levofloxacin zielen vorzugsweise entweder auf DNA-Gyrase oder Topoisomerase IV22 ab. Delafloxacin (DLX) ist ein Fluorchinolon-Antibiotikum der 4. Generation, das mit ähnlicher Wirksamkeit sowohl auf die Enzyme DNA-Gyrase als auch Topoisomerase IV abzielt23,24,25. Aufgrund dieses dualen Targetings ging man davon aus, dass eine Resistenz gegen DLX selten vorkommt24,26,27, doch wurde kürzlich eine DLX-Resistenz bei klinischen Isolaten von S. aureus beobachtet28,29.

In dieser Studie untersuchen wir die Entwicklung der MRSA-Resistenz gegen Dual-Targeting-Antibiotika, indem wir die experimentelle Entwicklung mehrerer unabhängiger MRSA-Populationen in steigenden DLX-Konzentrationen nutzen. Wir beobachten, dass neben Mutationen in den DNA-Gyrase- und Topoisomerase-IV-Enzymen auch kodierende Sequenzmutationen in der Effluxpumpe SdrM (Staphylococcus-Arzneimittelresistenz) der Haupt-Facilitator-Superfamilie sowie genomische Amplifikationen von sdrM und den benachbarten Effluxpumpen sepA und lmrS weit verbreitet sind entwickelte Populationen und entwickeln sich typischerweise früher als die kanonischen Mutationen. Die Mutationen der sdrM-Kodierungssequenz verleihen eine moderate DLX-Resistenz und erhöhen die Entwicklungsfähigkeit einer solchen Resistenz, während die genomischen Amplifikationen zu einer hohen DLX-Resistenz führen. Die Variation der Kopienzahl der amplifizierten Region hängt vom Selektionsdruck ab und führt zu einer Populationsheterogenität für die DLX-Resistenz. Wir stellen fest, dass die sdrM-Aktivität zwar den Fitnessvorteil für die Selektion dieser genomischen Amplifikationen bei DLX-Exposition bietet, das Trampen der benachbarten Effluxpumpen in der genomischen Amplifikation jedoch zu einer Kreuzresistenz gegen das Aminoglycosid Streptomycin führt. Darüber hinaus zeigen wir, dass bei fehlender sdrM-Aktivität die DLX-Resistenz Mutationen sowohl im DNA-Gyrase- als auch im Topoisomerase-IV-Enzym erfordert und daher seltener auftritt. Schließlich zeigen wir, dass sdrM-Genomamplifikationen und -Mutationen auch in Populationen aus jeweils einem MRSA- und einem Methicillin-sensitiven S. aureus (MSSA)-Klinikisolat nach Selektion auf DLX-Resistenz häufig vorkommen.

Wir haben zehn unabhängige Populationen des MRSA-Stamms JE2 in steigenden DLX-Konzentrationen für 7–10 tägliche Passagen entwickelt. DLX hemmt sowohl die DNA-Gyrase- als auch die Topoisomerase-IV-Enzyme mit ähnlicher Wirksamkeit, was die Möglichkeit erhöht, dass sich selten eine Resistenz gegen DLX entwickelt27. Allerdings konnten alle zehn Populationen in DLX-Konzentrationen wachsen, die dem 64–1024-fachen der minimalen Hemmkonzentration (MIC) des Elternstamms JE2 entsprachen (Ergänzungsdatensatz 1, siehe Materialien und Methoden zur Stammnomenklatur). Der JE2-Stamm hatte eine MHK von 0,133 ± 0,027 μg/ml in MH2-Medium, was unter dem klinischen Grenzwert von 0,25 μg/ml23,24,25 liegt. Drei einzelne Isolate aus der Endpassage jeder entwickelten Population wurden auf DLX-Resistenz getestet und alle Isolate zeigten DLX-MIC-Werte zwischen ~2 und 33 μg/ml (ergänzende Abbildung 1a), was die Entwicklung einer hohen DLX-Resistenz bestätigt. Wir führten eine Sequenzierung des gesamten Genoms dieser Isolate sowie zusätzlicher Isolate und Populationen aus früheren Passagen der Evolution durch (Ergänzungsdatensatz 2). Wie erwartet wiesen mehrere resistente Isolate und Populationen Mutationen in Genen auf, die für die Untereinheiten der DNA-Gyrase (gyrA oder gyrB) oder der Topoisomerase IV (parC oder parE) oder beider kodieren (Abb. 1). Die meisten Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs), die in diesen kanonischen Zielen wie S85P und E88K in gyrA, R458L in gyrB, E84K und A116V in parC sowie D432G und P585S in parE entstanden sind, befinden sich in der Chinolonresistenz-bestimmenden Region (QRDR). dieser Proteine ​​und wurden zuvor mit Fluorchinolonresistenz in Verbindung gebracht26,30,31,32,33. Wir haben in unseren Mutanten auch andere Mutationen wie W592R in gyrB, S520R in parC und S437P in parE identifiziert, bei denen es sich möglicherweise um neuartige DLX-Resistenzallele handelt.

Das Vorhandensein von Mutationen in Genen, die für DNA-Gyrase-Untereinheiten (gyrA, gyrB) und DNA-Topoisomerase-IV-Untereinheiten (parC, parE), die drei mutierten Allele sdrM1*, sdrM2* und sdrM3* sowie eine genomische Amplifikation, die sdrM enthält, werden gezeigt Populationen aus Zwischenpassagen sowie die drei Isolate aus der Endpassage für die zehn unabhängig entwickelten Populationen. Für jede unabhängige Population werden die früheren bis späteren Übergänge von links nach rechts angezeigt. Blaue oder gelbe Quadrate zeigen das Vorhandensein der Mutation (SNP oder Amplifikation) in einer Population bzw. einem terminalen Isolat. Die terminalen DLX-Konzentrationen stellen die Endkonzentrationen des Evolutionsexperiments dar (zu diesem Zeitpunkt wurden die Isolate erhalten).

Trotz der zahlreichen kanonischen Zielmutationen trugen mehrere resistente Isolate sowie Populationen aus Zwischenpassagen der meisten der zehn unabhängigen Populationen keine kanonischen Mutationen in Genen, die für die DNA-Gyrase- oder Topoisomerase-IV-Enzyme kodierten, oder wiesen Mutationen nur in einem dieser Gene auf Ziele (Abb. 1 und ergänzender Datensatz 2). Dazu gehören alle Proben aus den Populationen 1, 3 und 6 sowie die Populationen aus mehreren frühen Passagen der Populationen 2, 4, 5, 7, 8 und 9. Entwickeltes gyrA* (gyrAE88K) oder parE* (parED432G) Mutierte Allele führten einzeln zu einem leichten Anstieg der DLX-MICs auf bis zu 0, 4 μg / ml (ergänzende Abbildung 1b), was darauf hindeutet, dass andere Gene wahrscheinlich eine Rolle bei der DLX-Resistenz in mehreren unserer entwickelten Populationen spielen.

Eine weitere Untersuchung unserer Ergebnisse der Gesamtgenomsequenzierung ergab, dass Mutationen im Effluxpumpen-SdrM (Staphylococcus-Arzneimittelresistenz) in den entwickelten Populationen häufig vorkamen (Abb. 1). SdrM ist eine Effluxpumpe aus der Major Facilitator Superfamily (MFS)34. Es wurde gezeigt, dass eine Überexpression von SdrM zu einem zweifachen Anstieg der MHK-Werte von Norfloxacin und Ethidiumbromid führt. Diese Effluxpumpe war jedoch nicht an der Entwicklung von Antibiotikaresistenzen beteiligt34. Im Gegensatz zu typischen Effluxpumpenmutationen, die in der Promotorregion (oder in einem Repressor) auftreten, beobachteten wir, dass acht der zehn entwickelten Populationen eine von zwei Mutationen der sdrM-kodierenden Sequenz enthielten, Y363H (sdrM1*) oder A268S (sdrM2*). aber keines der entwickelten Isolate hatte beides (Abb. 1, Ergänzungsdatensatz 2), was die Möglichkeit erhöht, dass diese beiden Mutationen eine ähnliche Funktionalität haben könnten. Population 6 wies zusätzlich zur A268S-Mutation (sdrM3*) eine Mutation stromaufwärts der sdrM-Kodierungssequenz (an der Position −164) auf, die die Regulierung der sdrM-Expression beeinflussen könnte.

Der Abgleich der SdrM-Aminosäuresequenz mit anderen bekannten MFS-Effluxpumpen unter Verwendung der Conserved Domain Database35 zeigte, dass sich die A268- und Y363-Reste wahrscheinlich in der Bindungstasche der SdrM-Effluxpumpe befinden (ergänzende Abbildung 2), was darauf hindeutet, dass die Mutationen die Bindung beeinflussen von SdrM zu DLX. Die Visualisierung der vorhergesagten Proteinstruktur von SdrM mithilfe von AlphaFold36,37 zeigte, dass A268 und Y363 in unmittelbarer Nähe zueinander liegen (ergänzende Abbildung 3).

Zusätzlich zu den sdrM-Allelen ergab die Abdeckungsanalyse der Sequenzierungsergebnisse des gesamten Genoms, dass die Abdeckung des sdrM-Gens zwei- bis fünffach höher war als die mittlere Abdeckung des Genoms in mehrfach entwickelten Mutanten, verglichen mit einer etwa 1-fachen Abdeckung in der WT, was auf eine Amplifikation des sdrM-Gens in allen zehn entwickelten Populationen hinweist (Abb. 1, Ergänzungsdatensatz 2).

Wir konstruierten einzelne sdrM-Allelersatzmutanten im Wildtyp (WT) JE2-Stamm und bestimmten die Wirkung der entwickelten Allele auf die DLX-Resistenz und den DLX-Efflux. Konstruierte Mutanten mit den sdrM1*- oder sdrM2*-Allelen zeigten einen ~2-fachen Anstieg der DLX-Resistenz, während diejenigen, die das sdrM3*-Allel (das sowohl aus einer intergenen als auch einer kodierenden Sequenzierungsmutation besteht) trugen, einen ~4-fachen Anstieg zeigten (Abb. 2a). Wir haben die intrinsische Fluoreszenz von DLX38 gemessen, um indirekt die intrazelluläre Konzentration von DLX zu bestimmen (ergänzende Abbildung 4a). Wir haben die Effluxrate in den drei Allelersatzmutanten sowie im WT und einem Mutanten mit einer Transposon-Insertion in sdrM (sdrM::Tn) als Kontrollen berechnet (Abb. 2b). Wie erwartet wiesen die WT- und sdrM::Tn-Stämme die höchsten intrazellulären DLX-Konzentrationen auf, während die drei Allelersatzmutanten niedrigere Werte aufwiesen, was darauf hindeutet, dass die entwickelten sdrM-Allele zu einem erhöhten Efflux führten. Mithilfe eines vereinfachten mathematischen Modells haben wir festgestellt, dass die DLX-Ausflussraten von sdrM1*, sdrM2* und sdrM3* etwa 2–9x höher waren als bei sdrM::Tn, während die WT-Rate ähnlich wie bei sdrM::Tn war. (Ergänzende Abbildung 4b).

a DLX MICs von WT und die drei sdrM-Allelersatzmutanten in M63. Die angezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung von fünf biologischen Replikaten. Die Signifikanz wird für den Vergleich mit dem WT oder zwischen Mutanten, wie angegeben, gezeigt, wie durch eine einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Test für mehrere Vergleiche getestet (*P < 0,05, P für WT vs. sdrM1 = 0,0138, WT vs. sdrM2 = 0,0486, * *P < 0,01, sdrM1* vs. sdrM3* P = 0,0015, ***P < 0,001, sdrM2* vs. sdrM3* P = 0,0004, ****P < 0,0001). b Die normalisierte Fluoreszenz (intrinsische Fluoreszenz von DLX/OD600) wurde für die angegebenen Stämme als Proxy für die intrazelluläre DLX-Konzentration gemessen. Die angezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardfehler von drei biologischen Replikaten. c Prozentsatz der 12 unabhängigen Populationen der angegebenen Stämme, die im Laufe der Zeit eine DLX-Resistenz entwickelten, wenn sie sich im 2,5-fachen der jeweiligen DLX-MICs entwickelten. Quelldaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Anhand unserer Ergebnisse der Sequenzierung des gesamten Genoms haben wir beobachtet, dass in acht der zehn entwickelten Populationen sdrM-Mutationen (entweder ein SNP oder die Amplifikation) bei einer früheren Passage im Vergleich zu den kanonischen DNA-Gyrase- oder Topoisomerase-IV-Mutationen auftraten (Abb. 1). Dies deutet auf eine Evolutionskaskade hin, in der Effluxpumpenmutationen die Auswahl kanonischer Mutationen für DLX-Resistenz erleichtern. Um zu testen, ob sdrM-Mutationen die Entwicklungsfähigkeit der Resistenz in Gegenwart von DLX beeinflussen können, haben wir jeweils 12 unabhängige WT-Populationen entwickelt, und Mutanten, die die einzelnen sdrM-Mutationen trugen, entwickelten Allele mit täglichen Passagen in festen Konzentrationen von Delafloxacin, die dem 2,5-fachen der jeweiligen MHK entsprachen . Während nur eine WT-Population eine Resistenz entwickelte, entwickelten jeweils 3–4 Populationen von sdrM1*, sdrM2* und sdrM3* während des Experiments eine Resistenz (Abb. 2c).

Wir untersuchten die Alleldiversität des SdrM-Proteins, um festzustellen, ob die von uns identifizierten entwickelten Allele (A268S und Y363H) oder andere Mutationen in der Bindungstasche von SdrM in öffentlich zugänglichen Genomen von S. aureus-Isolaten vorkommen. Die JE2-SdrM-Proteinsequenz wurde anhand eines Satzes von 63.980 S. aureus-Genomen aus der NCBI Pathogen Detection-Datenbank abgefragt. Während an Position Y363 keine Mutationen beobachtet wurden, identifizierten wir einen Stamm mit einer A268S-Mutation und weitere sieben Stämme mit einer A268V-Mutation (Ergänzungsdatensatz 3). Darüber hinaus wiesen diese S. aureus-Stämme zahlreiche Mutationen in anderen Resten der vorhergesagten SdrM-Bindungstasche auf.

Zusätzlich zu den Punktmutationen in sdrM haben wir aus unseren Sequenzierungsdaten des gesamten Genoms in unseren zehn entwickelten Populationen 13 verschiedene Arten von Amplifikationen identifiziert, die das sdrM-Gen amplifizierten (Abb. 1 und 3a, ergänzender Datensatz 4, ergänzende Abb. 5). . Mindestens eine Instanz jedes Amplifikationstyps wurde durch PCR und Sanger-Sequenzierung der neuen Verbindungsstellen bestätigt. Ein Ende jeder Amplifikation befand sich innerhalb eines rRNA-tRNA-Genclusters stromabwärts von sdrM (Terminal 1), während das andere Ende entweder innerhalb oder zwischen den fünf Genen stromaufwärts von sdrM (Terminal 2) lag (Abb. 3a). Während fünf dieser Amplifikationen eine Mikrohomologie von 4–12 Basenpaaren zwischen den beiden Terminals aufwiesen, wiesen die anderen entweder eine einzelne Basenpaarhomologie oder keine Homologie auf (Ergänzungsdatensatz 4). Mehrere der Amplifikationen wurden in mehreren Populationen gefunden und in einigen Populationen wurden unterschiedliche Amplifikationen in verschiedenen Passagen beobachtet, was darauf hinweist, dass die Amplifikationen dynamisch sind (ergänzende Abbildung 6). Das sdrM-Gen befindet sich stromaufwärts von zwei zusätzlichen Effluxpumpen sepA und lmrS39,40, und beide Gene waren in allen Fällen in den Amplifikationen vorhanden (Abb. 3a). Die Gennachbarschaftsanalyse unter Verwendung der STRING-Datenbank41 ergab, dass die drei Effluxpumpen (zusammen mit einem Protein der Hämolysin-III-Familie) bei fast allen Staphylococcus-Arten nebeneinander im Genom vorkommen (ergänzende Abbildung 7).

a Der genomische sdrM-Locus und die 13 verschiedenen Arten von Effluxpumpen-Genamplifikationen, die in den entwickelten Populationen beobachtet wurden. Die Regionen, die in allen Fällen die beiden Enden der Amplifikation enthalten, werden angezeigt (Terminals 1 und 2). b Relative Leseabdeckung der amplifizierten Regionen im Vergleich zum gesamten Genom für die angegebenen Stämme. Die Linien stellen eine geglättete Anpassung unter Verwendung eines verallgemeinerten additiven Modells unter Berücksichtigung der nächsten 100 Nachbarn dar. c Faltungsänderung der Kopienzahl von sdrM, lmrS und sepA in den angegebenen Isolaten im Vergleich zum WT, gemessen durch qPCR genomischer DNA. Die angezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung von drei technischen Replikaten. d Faltungsänderung in der Expression von sdrM, lmrS und sepA in den angegebenen Isolaten im Vergleich zu WT, gemessen durch RT-qPCR. Die angezeigten Daten sind der Mittelwert zweier biologischer Replikate. e DLX-MICs der angegebenen Isolate in M63. Die angezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten. f Normalisierte Fluoreszenz (intrinsische Fluoreszenz von DLX/OD600) der angegebenen Stämme als Proxy für die intrazelluläre DLX-Konzentration. Die angezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardfehler von drei biologischen Replikaten. Die Signifikanz wird für den Vergleich mit dem auf 1 gesetzten c-WT-Wert, getestet durch einen Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von einem unkorrigierten Dunn-Test für jeden Vergleich, und dem e-WT, getestet durch Brown-Forsythe- und Welch-Einfaktor-ANOVA-Tests, gefolgt von einem ungepaarten, gezeigt Zweiseitiger t-Test mit Welch-Korrektur für jeden Vergleich (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001). c 1,7a: P für sdrM = 0,0025, lmrS = 0,0079, sepA = 0,0025, 4,2a: P für sdrM = 0,0279, lmrS = 0,0438; und e, P für 1,7a = 0,0295, 4,2a = 0,0238, 6c = 0,006. Quelldaten für b–f werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Auswirkungen der genomischen Amplifikationen weiter zu charakterisieren, analysierten wir drei entwickelte Isolate, die nur nicht-kanonische Mutationen enthielten – 1.7a, 4.2a und 6c. Es wurde vorhergesagt, dass alle drei Isolate Effluxpumpenamplifikationen aufwiesen, wobei 1.7a Amplifikationstyp 9 und sowohl 4.2a als auch 6c Amplifikationstyp 1 aufwiesen (Abb. 3b, Ergänzungsdatensatz 4). Während 4.2a das WT-sdrM-Allel aufwies, hatte 1.7a das sdrM2*-Allel und 6c wies in den Sequenzierungsdaten des gesamten Genoms ~40 % der Reads auf, die dem sdrM3*-Allel zugeordnet waren, was darauf hindeutet, dass die Amplifikation sowohl WT- als auch sdrM3*-Allele enthielt. Darüber hinaus wiesen 1.7a und 6c Mutationen in einigen anderen nicht-kanonischen Genen auf, diese Mutationen hatten jedoch keinen Einfluss auf die DLX-Resistenz (Supplementary Dataset 2, Supplementary Abb. 8).

Die sdrM-, lmrS- und sepA-Gene zeigten einen drei- bis zehnfachen Anstieg der Kopienzahl in 1.7a, 4.2a und 6c, während ein Kontrollisolat, 3a, von dem vorhergesagt wurde, dass es keine Amplifikation aufwies, eine ähnliche Kopie zeigte Anzahl zum WT, gemessen durch genomische DNA-qPCR und Abdeckungsdaten aus der Sequenzierung des gesamten Genoms (Abb. 3b, c, ergänzende Abb. 9). Darüber hinaus zeigten 1.7a, 4.2a und 6c einen 5–500-fachen Anstieg der Genexpression der drei Effluxpumpen im Vergleich zum WT-Stamm, gemessen durch quantitative Reverse-Transkriptions-PCR (RT-qPCR) (Abb. 3d). Die dramatisch höhere Expression im Vergleich zur Kopienzahl, insbesondere in 1.7a und 4.2a, spiegelt wahrscheinlich eine veränderte Regulierung der Effluxpumpen in den Amplifikationen wider. Alle drei Isolate hatten eine etwa 5–100-fach höhere DLX-Resistenz und einen hohen DLX-Efflux im Vergleich zum ursprünglichen WT-Stamm (Abb. 3e, f).

Um zu testen, ob die Überexpression der verstärkten Effluxpumpen einzeln oder in Kombination die DLX-Resistenz erhöhen kann, haben wir sepA, lmrS oder die parentalen oder entwickelten sdrM-Allele unter der Kontrolle der entsprechenden nativen Promotoren unter Verwendung des pKK30-Plasmids42 überexprimiert. In diesen Stämmen erhöhte sich die Expression der Effluxpumpen im Vergleich zu einer Leervektorkontrolle um das etwa 10- bis 100-fache (ergänzende Abbildung 10a). Die Überexpression des WT-sdrM-Allels führte zu einem etwa 2-fachen Anstieg der DLX-Efflux-Aktivität und -Resistenz, während die Allele sdrM1*, sdrM2* und sdrM3* einen etwa 4- bis 6-fachen Anstieg zeigten (ergänzende Abbildung 10b, c). . Darüber hinaus führte die Überexpression von sepA und lmrS nicht zu einem signifikanten Anstieg der DLX-Resistenz, und die Überexpression aller drei Effluxpumpen führte zu einer ähnlichen Resistenz wie die Überexpression des WT-sdrM-Allels, was darauf hindeutet, dass die Überexpression von sdrM wahrscheinlich der Hauptverursacher der durch verursachten DLX-Resistenz ist die genomischen Amplifikationen (ergänzende Abbildung 10b).

Amplifikationsinstabilität führt häufig zu Veränderungen der Kopienzahl und damit der Expression, die von der selektiven Stärke der Umgebungsbedingungen abhängen können12,14. Um die Stabilität der Amplifikation zu testen, haben wir 1.7a und 6c zwei Tage lang in zwei DLX-Konzentrationen sowie antibiotikafreien Medien passagiert und die sdrM-Leseabdeckung für jede Passage mithilfe der Sequenzierung des gesamten Genoms bestimmt. Die Kopienzahl von sdrM stieg bei der Passage in DLX an und nahm bei der Passage ohne das Antibiotikum ab, was darauf hindeutet, dass die sdrM-Kopienzahl und wahrscheinlich auch ihre Expression in den genomischen Amplifikationen von der Höhe der DLX-Exposition abhängt (Abb. 4a, b). . Darüber hinaus nahm die Häufigkeit der beiden Mutationen im sdrM3*-Allel (A268S-Kodierungssequenzmutation und eine Upstream-Mutation) in 6c bei DLX-Passage zu und nahm bei Passage in antibiotikafreien Medien ab (Abb. 4a). Die Isolate, die zwei Tage lang in der höheren DLX-Konzentration passagiert worden waren und eine höhere Amplifikationskopienzahl aufwiesen, zeigten auch einen etwa zweifachen Anstieg der DLX-Resistenz für 6c und einen leichten Anstieg für 1.7a (Abb. 4c, d). ).

a Kopienzahl von sdrM und die Allelfrequenzen der beiden Mutationen, die das sdrM3*-Allel in 6c bilden, bei Passage entweder in keinem DLX-Medium oder in zwei DLX-Konzentrationen. b Kopieren Sie die Anzahl der sdrM in 1.7a nach Passage entweder in keinem DLX-Medium oder in zwei DLX-Konzentrationen. Für beide werden Daten aus zwei unabhängigen Passagexperimenten angezeigt. c, d DLX-MICs in M63 von 6c- und 1.7a-Populationen nach der zweiten Passage entweder ohne DLX, 4 μg/ml DLX (DLX 4) oder c 6 μg/ml DLX (DLX 6) für 6c und d 8 μg/ml DLX (DLX 8) für 1,7a. Die gezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung von jeweils zwei biologischen Replikaten aus zwei unabhängigen Passagexperimenten. e MHKs von WT, 1.7a oder 1.7a, gewachsen über Nacht in 2 μg/ml DLX (1.7a_DLX), für die angegebenen Antibiotika in MH2. Die angezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten. f Streptomycin-MICs der pKK30-Überexpressionsstämme in MH2. Die angezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung von vier biologischen Replikaten. Die Signifikanz wird für den Vergleich mit a–d der entsprechenden Kontrolle ohne DLX, e WT und f dem Stamm, der den leeren Vektor trägt, gezeigt, wie durch eine einfaktorielle ANOVA mit dem Holm-Sidak-Test für mehrere Vergleiche getestet (*P < 0,05, * *P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001). a Für „relative sdrM-Abdeckung“ DLX 4 μg/ml: P für Passage 1 = 0,0012, Passage 2 = 0,0067, DLX 6 μg/ml: P für Passage 1 = 0,001, Passage 2 = 0,0018; für „Allelfrequenz von A268S“ DLX 4 μg/ml: P für Passage 1 = 0,0052, Passage 2 = 0,0164, DLX 6 μg/ml: P für Passage 1 = 0,0052, Passage 2 = 0,0097; und für „Allelhäufigkeit der intergenen Mutation“ DLX 4 μg/ml: P für Passage 1 = 0,0018, DLX 6 μg/ml: P für Passage 1 = 0,0018; b, DLX 4 μg/ml: P für Passage 1 = 0,0312, Passage 2 = 0,0020 und DLX 8 μg/ml: P für Passage 1 = 0,0092; dP für DLX 8 μg/ml = 0,048; e, Acriflavin: P für 1,7a = 0,0025, 1,7a_DLX = 0,0002; Chloramphenicol: P für 1,7a_DLX = 0,0035; f P für sdrM+lmrS+sepA = 0,0001. Quelldaten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Angesichts der Anwesenheit von drei Effluxpumpen in der Amplifikation und der daraus resultierenden hohen Expression haben wir die Resistenz von 1.7a, das mit und ohne DLX gezüchtet wurde, gegen eine Reihe verschiedener Antibiotika getestet. Während wir gegen die meisten Antibiotika keine erhöhte Resistenz feststellen konnten, zeigte das in DLX gezüchtete 1.7a eine Kreuzresistenz gegen das Aminoglykosid Streptomycin (Abb. 4e). Darüber hinaus führte die Überexpression aller drei Effluxpumpen, jedoch nicht von sdrM allein, zu einem ähnlichen Anstieg der Streptomycin-Resistenz (Abb. 4f), was darauf hinweist, dass die Streptomycin-Resistenz auch eine erhöhte Expression von lmrS und sepA erforderte.

Der sdrM::Tn-Stamm wies im Vergleich zum WT keine zusätzlichen Mutationen auf, zeigte ein ähnliches Wachstum wie der WT in M63 (ergänzende Abb. 11a, b) und hatte eine um das Zweifache niedrigere MHK als der WT (Abb. 5a), was darauf hinweist dass SdrM zum intrinsischen DLX-Resistenzniveau des WT-MRSA-Stammes beiträgt. Um die Rolle von sdrM bei der Auswahl der genomischen Amplifikationen zu verstehen, haben wir, ähnlich wie bei unserer ursprünglichen Entwicklung, jeweils drei unabhängige Populationen des Transposon-Mutantenstamms sdrM::Tn und des WT (als Kontrolle) in steigenden DLX-Konzentrationen entwickelt. Wir haben bestätigt, dass die Transposon-Insertion während der Evolution in allen drei sdrM::Tn-entwickelten Populationen stabil war (ergänzende Abbildung 11c). Während der Evolution wuchsen die Populationen in DLX-Konzentrationen, die etwa dem 640- bis 1000-fachen der jeweiligen MHK-Werte entsprachen, und terminal entwickelte Populationen sowohl für den WT als auch für sdrM::Tn zeigten hohe DLX-MHK-Werte (ergänzende Abbildung 11d). Wir sahen genomische Amplifikationen des sdrM-Locus in zwei der drei unabhängig voneinander entwickelten WT-Populationen. Während die dritte Population auch mit der Amplifikation verbundene Übergänge aufwies, lag der Anstieg der Kopienzahl unter unserem 1,3-fachen Schwellenwert, der auf das Vorhandensein einer Amplifikation hinweist. Jede WT-Population wies einen neuartigen Amplifikationstyp auf, der in der ursprünglichen Entwicklung nicht vorkam (Ergänzungsdatensatz 4). Allerdings wies keine der sdrM::Tn-Populationen diese Amplifikationen auf (Abb. 5b). Darüber hinaus wiesen im Gegensatz zu den WT-Populationen alle sequenzierten Populationen aus den Zwischen- und Endpassagen der sdrM::Tn-Entwicklungen Mutationen sowohl im DNA-Gyrase- als auch im Topoisomerase-IV-Enzym auf, was darauf hindeutet, dass die hohe DLX-Resistenz im Gegensatz dazu auf duale Zielmutationen zurückzuführen ist zu Verstärkungen (Abb. 5b).

a DLX-MICs der WT- und sdrM::Tn-Stämme in M63. Die angezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten. Die Signifikanz wird für den Vergleich mit dem WT angezeigt, der mit einem ungepaarten zweiseitigen t-Test (*P = 0,0112) getestet wurde. b Das Vorhandensein von Mutationen in Genen, die für DNA-Gyrase-Untereinheiten (gyrA, gyrB) und DNA-Topoisomerase-IV-Untereinheiten (parC, parE), die drei mutierten Allele sdrM1*, sdrM2* und sdrM3* sowie eine genomische Amplifikation, die sdrM enthält, werden gezeigt für Populationen aus Zwischenpassagen von jeweils drei unabhängig voneinander entwickelten Populationen der WT- und sdrM::Tn-Stämme. c Die Überlebensfraktion für die angegebenen Isolate in mehreren DLX-Konzentrationen im Vergleich zu einer Kontrolle ohne DLX, gemessen als KBE/ml auf den jeweiligen Platten. Die angezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten. d Prozentsatz der 12 unabhängigen Populationen der angegebenen Stämme, die im Laufe der Zeit eine DLX-Resistenz im 2,5-fachen der jeweiligen DLX-MICs entwickelten (0,55 µg/ml für den WT und 0,32 µg/ml für sdrM::Tn). Quelldaten für (a, c, d) werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Es ist bekannt, dass Amplifikationen instabil sind und häufig der Antibiotika-Heteroresistenz in Populationen zugrunde liegen43,44, während Resistenzen aufgrund von Veränderungen in der DNA-Sequenz voraussichtlich stabiler und homogener sind. Wir haben daher die Populationsheterogenität auf Antibiotikaresistenz in den entwickelten Isolaten 1.7a und 6c getestet, die genomische Amplifikationen, aber keine kanonischen Zielmutationen aufweisen, sowie in einem Isolat aus der letzten Passage einer entwickelten sdrM::Tn-Population, die Mutationen aufweist gyrA, gyrB und parE (Abb. 5b, Ergänzungsdatensatz 2). Wir haben die Isolate über Nacht in antibiotikafreien Medien gezüchtet und dann den Anteil der Population bestimmt, der in verschiedenen DLX-Konzentrationen wachsen konnte. Wir beobachteten, dass das sdrM::Tn-entwickelte Isolat (Tn_3b) bei allen getesteten Konzentrationen ~100 % DLX-Resistenz aufwies, 1.7a und 6c jedoch Populationsheterogenität zeigten, wobei nur ~10 % oder weniger Zellen gegen DLX resistent waren (Abb. 5c). .

Das Vorhandensein von Mutationen in beiden Zielenzymen in allen entwickelten sdrM::Tn-Populationen (Abb. 5b) legt nahe, dass Mutationen in beiden Zielen in Abwesenheit von sdrM für eine hohe DLX-Resistenz wesentlich sind. Wir haben daher getestet, ob das Vorhandensein von sdrM die Entwicklungsfähigkeit der DLX-Resistenz beeinflusst, ähnlich wie im Experiment, bei dem die entwickelten sdrM-Allele getestet wurden (Abb. 2c). Wir haben jeweils 12 unabhängige Populationen von WT und sdrM::Tn in festen DLX-Konzentrationen entwickelt, die dem 2,5-fachen der jeweiligen MHK für jeden Stamm entsprachen (0,55 μg/ml für WT und 0,32 μg/ml für sdrM::Tn). ein zusätzlicher Wachstumstag am 5. Tag, um die Resistenzentwicklung zu unterstützen. Während 5 der 12 WT-Populationen innerhalb von 6 Tagen eine DLX-Resistenz entwickelten, entwickelte nur 1 von 12 sdrM::Tn-Populationen innerhalb von 8 Tagen eine Resistenz, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein von sdrM die Entwicklungsfähigkeit der DLX-Resistenz erhöht (Abb. 5d).

Wir haben zwei klinische S. aureus-Isolate auf das Auftreten von sdrM-Mutationen und Amplifikation bei der Entwicklung einer DLX-Resistenz getestet. Die beiden klinischen S. aureus-Isolate wurden ursprünglich aus zwei Mukoviszidose-Patienten isoliert. CF001 ist ein MRSA-Stamm des klonalen Komplexes 8 (CC8)-Sequenztyp 8 (ST8) und CF106 ist ein CC1 ST188 MSSA-Stamm (Ergänzungsdatensatz 5). Während CF001 einen DLX-MIC-Wert hatte, der etwa 2-mal niedriger war als der unseres WT-Stammes JE2, war der DLX-MIC-Wert von CF106 etwa 50-mal niedriger als der von JE2 (Abb. 6a). Wir haben jeweils drei unabhängige Populationen von CF001 und CF106 in steigenden DLX-Konzentrationen entwickelt und Populationen aus Zwischenpassagen sequenziert (Abb. 6b). Zwei von drei Populationen von CF001 und CF106 hatten das sdrM2*-Allel, während alle evolvierten CF001- und CF106-Populationen genomische sdrM-Amplifikationen aufwiesen.

a DLX MICs von JE2 (WT) und den beiden klinischen Isolaten CF001 und CF106. Die angezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten. Die Signifikanz wird für den Vergleich mit dem WT gezeigt, der durch eine einfaktorielle ANOVA mit dem Holm-Sidak-Test für mehrere Vergleiche getestet wurde (**P = 0,0024, ****P < 0,0001). b Das Vorhandensein von Mutationen in Genen, die für DNA-Gyrase-Untereinheiten (gyrA, gyrB) und DNA-Topoisomerase-IV-Untereinheiten (parC, parE), die drei mutierten Allele sdrM1*, sdrM2* und sdrM3* sowie eine genomische Amplifikation, die sdrM enthält, werden gezeigt für Populationen aus Zwischenpassagen von drei unabhängig voneinander entwickelten Populationen der klinischen Isolate CF001 und CF106. Quelldaten für a werden in der Quelldatendatei bereitgestellt.

Resistenzen gegen Antibiotika mit mehr als einem zellulären Ziel erfordern wahrscheinlich mehrere Mutationen in einer Zelle und werden daher voraussichtlich selten auftreten. Allerdings sind die Evolutionspfade, die zur Resistenz gegen solche Antibiotika führen, nicht genau charakterisiert. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Entwicklung von MRSA bei Exposition gegenüber dem Dual-Targeting-Fluorchinolon DLX der 4. Generation zu einer Resistenz sowohl über die kodierende Sequenz als auch über Upstream-Mutationen in sdrM, dem Gen, das für eine schlecht charakterisierte Effluxpumpe der Major Facilitator-Superfamilie kodiert, führte Genamplifikationen von sdrM. Darüber hinaus führte das Vorhandensein von zwei zusätzlichen Effluxpumpen neben dem sdrM-Locus und deren anschließende Mitnahme bei der genomischen Amplifikation zu einer Kreuzresistenz gegen das Aminoglycosid Streptomycin. In Abwesenheit von sdrM erforderten Stämme Mutationen in beiden kanonischen Zielen, DNA-Gyrase und Topoisomerase IV, um eine DLX-Resistenz zu erreichen, und wiesen daher eine verringerte Entwicklungsfähigkeit der DLX-Resistenz auf. Die sdrM-Mutationen und -Amplifikationen stellten somit einen leichter zugänglichen adaptiven Weg zu einer hohen DLX-Resistenz bereit. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Antibiotika mit mehreren Zielen unbeabsichtigt zu alternativen adaptiven Trajektorien führen können, die nicht nur eine schnelle Entwicklung von Resistenzen ermöglichen, sondern auch zu weiteren ungünstigen Veränderungen in der bakteriellen Fitnesslandschaft führen.

Man geht davon aus, dass Effluxpumpen den Zellen bei Antibiotikaeinwirkung einen schnellen Schutz bieten, und Mutationen von Effluxpumpen werden häufig mit Antibiotikaresistenzen in Verbindung gebracht45. In MRSA sind mehrere Effluxpumpen aus mehreren Proteinfamilien vorhanden. Zu den Pumpen der MFS-Familie gehören chromosomal kodierte NorA, NorB, NorC, LmrS, MdeA und SdrM, und eine plasmidbasierte Überexpression dieser Pumpen kann Resistenz gegen Fluorchinolone, quartäre Ammoniumverbindungen und Farbstoffe verleihen46,47. Während Mutationen in norA mit der Entwicklung von Antibiotikaresistenzen, insbesondere gegen Fluorchinolone, in Verbindung gebracht werden48, wurden sdrM-Mutationen bisher nicht in Verbindung gebracht. Unsere Studie zeigt somit, dass weniger gut charakterisierte Effluxpumpen eine Rolle bei der Entstehung von AMR spielen könnten, insbesondere gegen neu entwickelte antimikrobielle Mittel. Darüber hinaus wurde zuvor vermutet, dass eine plasmidbasierte Überexpression von lmrS und sepA in E. coli oder einem Methicillin-empfindlichen S. aureus-Stamm zu einer erhöhten Resistenz gegen mehrere Antibiotika, einschließlich Linezolid, Erythromycin und Kanamycin, führen könnte39,40,49. Allerdings konnten wir bei unseren entwickelten Isolaten, die diese Effluxpumpen überexprimierten, keine Kreuzresistenz gegen diese Antibiotika beobachten, was darauf hindeutet, dass diese Resistenz möglicherweise spezifisch für E. coli oder den Stamm S. aureus ist.

Antibiotikaresistenz-assoziierte Effluxpumpenmutationen erhöhen typischerweise die Expression der Effluxpumpe und verringern dadurch die Antibiotikakonzentration in der Zelle. Solche Mutationen sind am häufigsten entweder in der Promotorregion oder in einem Repressor der Pumpe lokalisiert, obwohl auch genomische Amplifikationen von Effluxpumpen beobachtet wurden50,51. In unseren Entwicklungen haben wir keine Transkriptionsrepressormutationen identifiziert, die die sdrM-Expression erhöhen würden, und nur eine Population wies eine Mutation stromaufwärts von sdrM auf, wohingegen sdrM-Amplifikationen in allen zehn unabhängig voneinander entwickelten Populationen häufig vorkamen. Dies deutet darauf hin, dass der erhebliche Anstieg der sdrM-Expression, der für eine hohe DLX-Resistenz erforderlich ist, über Promotor- oder Repressormutationen weitgehend nicht zugänglich ist. In den entwickelten Isolaten mit Amplifikationen waren die Expressionsniveaus von sdrM und den angrenzenden Effluxpumpen lmrS und sepA viel höher im Vergleich zur Kopienzahl der kodierenden Gene (Abb. 3c, d), was darauf hindeutet, dass die Regulation dieser Gene in verändert ist Verstärkung. Interessanterweise befindet sich ein Cluster von tRNA-rRNA-Genen, die typischerweise extrem stark exprimiert werden, stromabwärts von sdrM, lmrS und sepA, wird jedoch stromaufwärts der amplifizierten Kopien der für die Effluxpumpe kodierenden Gene positioniert. Dies erhöht die Möglichkeit, dass die Read-Through-Transkription der tRNA-rRNA-Gene zu der stark erhöhten Effluxpumpenexpression führt, die wir in unseren entwickelten Isolaten mit Amplifikationen beobachtet haben, ähnlich einer früheren Beobachtung bei Streptococcus pneumoniae51.

Es wurde auch gezeigt, dass Mutationen der Kodierungssequenz in Effluxpumpen die Antibiotikaresistenz bei Pseudomonas aeruginosa (mexB, mexY), Klebsiella pneumoniae (kmrA) und Neisseria gonorrhoeae (mtrD) erhöhen, was wahrscheinlich auf eine erhöhte Affinität für das Antibiotikum zurückzuführen ist52,53,54. Jüngste Studien deuten darauf hin, dass eine erhöhte Expression von Effluxpumpen auch die Antibiotikaresistenz erleichtern könnte, indem sie die Mutationsrate erhöht55,56, die Expression von Resistenzdeterminanten beim Plasmiderwerb ermöglicht57 oder die Selektion von Resistenzmutationen aufgrund der erhöhten Fitness bei Antibiotikaexposition von Stämmen fördert, die beide tragen Resistenzmutationen und überexprimierende Effluxpumpen58. Wir fanden auch heraus, dass Mutationen der kodierenden Sequenz in der SdrM-Bindungstasche die DLX-Resistenz und den DLX-Ausfluss erhöhten, wahrscheinlich durch eine Veränderung der Bindung an DLX. Die sdrM3*-Upstream-Mutation führte wahrscheinlich zu erhöhten Werten der sdrM-Effluxpumpe, was wiederum zu einem stärkeren Anstieg des DLX-Effluxes und der DLX-Resistenz führte (Abb. 2a, b). Darüber hinaus führte der moderate Anstieg der DLX-Resistenz der mutierten sdrM-Allele zu einer erhöhten Entwicklungsfähigkeit der DLX-Resistenz im Vergleich zum WT, was darauf hindeutet, dass Mutationen der Kodierungssequenz-Effluxpumpe möglicherweise auch die Entwicklung zusätzlicher Mutationen erleichtern können, die zu höheren Resistenzniveaus führen , möglicherweise aufgrund einer synergistischen Zunahme der Resistenz oder einer erhöhten Fitness von Kombinationsmutanten. Schließlich zeigten wir, dass die Amplifikation von sdrM einen einstufigen adaptiven Weg zur DLX-Resistenz darstellte, während mindestens zwei Mutationen in den Enzymen DNA-Gyrase und Topoisomerase IV für eine hohe DLX-Resistenz in Abwesenheit von sdrM und in Anwesenheit von erforderlich waren Ein funktionelles sdrM-Gen erhöhte daher die Entwicklungsfähigkeit der DLX-Resistenz. Während der letztendlich erreichte Grad der DLX-Resistenz zwischen den WT- und sdrM::Tn-Stämmen ähnlich war (ergänzende Abbildung 11d), ermöglichte das Vorhandensein von sdrM im WT eine schnellere und häufigere Entwicklung der DLX-Resistenz (Abb. 5d). Da davon ausgegangen wird, dass genomische Amplifikationen viel häufiger vorkommen als Mutationen in der Genomsequenz12,14, ist es wahrscheinlich, dass die Kombination aus einer Mutation der sdrM-kodierenden Sequenz und einer Amplifikation auch häufiger auftrat als die Kombination von Mutationen der kodierenden Sequenz in den beiden Zielenzymen.

Mehrere Mutationen trugen zur DLX-Resistenz in unseren entwickelten Populationen bei, wobei die wichtigsten Determinanten wahrscheinlich die sdrM-entwickelten Allele, sdrM-Amplifikationen und die kanonischen Mutationen in den DNA-Gyrase- und Topoisomerase-Untereinheiten sind. Innerhalb dieser Kategorien beeinflussen wahrscheinlich die spezifischen vorhandenen sdrM-, gyrA-, gyrB-, parC- und parE-Allele sowie die Anzahl der sdrM-Amplifikationskopien die genauen beobachteten Resistenzniveaus. Einzelne Mutationen in den Gyrase- oder Topoisomerase-Enzymen sowie einzelne Kopien der entwickelten sdrM-Allele führen zu einem zwei- bis vierfachen Anstieg der DLX-MIC (ergänzende Abbildung 1b, Abbildung 2a), während Mutationen in beiden DNA Gyrase- und Topoisomerase-IV-Enzyme führen wahrscheinlich zu hohen DLX-MICs, die 40–250-fach höher sind als die WT, wie in den entwickelten sdrM::Tn-Populationen zu sehen ist (Abb. 5b). Amplifikationen von sdrM führen in ähnlicher Weise zu einer hohen DLX-Resistenz, was zu DLX-MICs führt, die 5–100-fach höher sind als der WT (Abb. 3e). Wir beobachteten eine 3–9-fach höhere DLX-Resistenz in unseren sdrM-Überexpressionsstämmen (ergänzende Abbildung 10b), die niedriger war als die Resistenz in den entwickelten Isolaten 1.7a, 4.2a und 6c (Abb. 3e). Dies war wahrscheinlich auf die deutlich höhere sdrM-Expression zurückzuführen, die in einigen dieser entwickelten Isolate beobachtet wurde (Abb. 3d, ergänzende Abb. 10a), sowie auf die Zunahme der Kopienzahl der sdrM-Amplifikation bei DLX-Exposition und die anschließende Zunahme der sdrM-Expression DLX-MICs (Abb. 4). Es ist unwahrscheinlich, dass die plasmidbasierte sdrM-Überexpression die dynamische Natur der genomischen Amplifikationen rekapituliert und somit einen direkten Vergleich der Resistenzniveaus zwischen den entwickelten Isolaten und den konstruierten Allelersatz- und Überexpressionsmutanten verhindert.

Es gibt eine erhebliche Vielfalt unter den in der Klinik isolierten S. aureus-Stämmen59, aber unsere Experimente zeigen, dass bei DLX-Exposition die Selektion auf genomische sdrM-Amplifikationen und zumindest auf das sdrM2*-Allel selbst bei klinischen Isolaten aus verschiedenen klonalen Komplexen häufig vorkommt. DLX wurde erst vor kurzem (im Jahr 2017) von der FDA für den klinischen Einsatz zugelassen26 und daher ist es unwahrscheinlich, dass die Selektion von DLX-Resistenzen in der Klinik und die anschließende Sequenzierung resistenter Isolate bisher üblich sind. Die wenigen DLX-resistenten klinischen S. aureus-Isolate, die in einer früheren Studie identifiziert und sequenziert wurden, wiesen Mutationen sowohl in den Enzymen DNA-Gyrase als auch Topoisomerase IV auf28. Diese Isolate wurden jedoch vor der DLX-Zulassung und der klinischen Verwendung gesammelt, und der Selektionsdruck und die Mutationspfade, die zum Erwerb der Zielmutationen führten, sind daher unbekannt. Eine weitere aktuelle Studie, die DLX-resistente klinische S. aureus-Isolate untersuchte, identifizierte ebenfalls Mutationen in den DNA-Gyrase- und Topoisomerase-IV-Untereinheiten und wies darauf hin, dass Effluxpumpen bei der DLX-Resistenz in mindestens einem Isolat eine Rolle spielen29. Unsere Analyse von mehr als 63.000 S. aureus-Genomen zeigte auch, dass A268S- und Y363H-Mutationen zwar selten sind, andere Mutationen in SdrM jedoch häufig vorkommen, darunter auch in Resten, die sich voraussichtlich in der Bindungstasche befinden. Diese Mutationen können möglicherweise die Resistenz von S. aureus und die Resistenzentwicklung gegen DLX und andere Antibiotika beeinflussen.

Genomische Duplikationen und Amplifikationen kommen schätzungsweise in 10 % der Bakterienzellen in wachsenden Kulturen vor und spielen aufgrund ihrer hohen Häufigkeit vermutlich eine wichtige Rolle bei der frühen Anpassung an Stress, einschließlich Antibiotikaresistenz12,14. Unsere Studie zeigt, dass genomische Amplifikationen von Effluxpumpen zu Antibiotikaresistenzen führen können und möglicherweise die ersten Schritte von Evolutionspfaden sind, die die schnelle Entwicklung stabilerer Resistenzmutationen ermöglichen, insbesondere wenn mehrere solcher Mutationen für ein hohes Maß an Resistenz erforderlich sind.

Genomische Amplifikationen sind typischerweise instabil und gehen ohne Selektionsdruck häufig verloren, was zu Populationsheterogenität und Antibiotika-Heteroresistenz führt43,44. Wir beobachteten in unserer Studie eine ähnliche Amplifikationsinstabilität, die zu einer Populationsheterogenität der DLX-Resistenz führte. Darüber hinaus führte die Behandlung mit hohen DLX-Konzentrationen zu einer erhöhten Amplifikationskopienzahl und damit zu einer erhöhten DLX-Resistenz sowie einer Kreuzresistenz gegen Streptomycin. Heteroresistenz gegen Fluorchinolone wurde in einer früheren Studie in klinischen Isolaten von vier Krankheitserregern selten beobachtet und dies wurde einer Resistenz zugeschrieben, die Zielmutationen erfordert44. Unsere Studie zeigt jedoch, dass bei MRSA genomische Amplifikationen von Effluxpumpen zu einer hohen Fluorchinolonresistenz führen können. Die Instabilität genomischer Amplifikationen führt wahrscheinlich dazu, dass sie in Labor- und klinischen Studien nicht ausreichend erkannt werden und ihre Rolle bei der Antibiotikaresistenz daher wahrscheinlich unterschätzt wird.

Wir haben die Kopienzahl der Amplifikation sowohl mithilfe von qPCR auf genomischer DNA als auch der Abdeckungstiefe in unseren Sequenzierungsproben des gesamten Genoms quantifiziert. Angesichts der Amplifikationsinstabilität und der daraus resultierenden Heterogenität selbst innerhalb einer ansonsten isogenen Population eines einzelnen Stamms kann jedoch eine lange Lesesequenzierung mit hoher Abdeckungstiefe erforderlich sein, um eine genauere Messung der Kopienzahlverteilung der Amplifikation in einer Population zu ermöglichen.

Interessanterweise wurden in unseren 13 unabhängigen WT-Populationen 16 verschiedene genomische Amplifikationstypen von sdrM beobachtet, und die Amplifikationen waren innerhalb jeder Population dynamisch, was ihre Instabilität noch deutlicher macht. Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass die gleiche Amplifikation in mehreren unabhängigen Populationen auftritt und selektiert wird, was darauf hindeutet, dass DNA-Brüche und Amplifikationen bevorzugt an bestimmten Genomstellen auftreten können. Die Sequenz der Amplifikationsverbindungen bestand entweder aus einer Mikrohomologie von höchstens 13 bp oder aus keiner Homologie, was unter dem für die RecA-vermittelte Rekombination erforderlichen Schwellenwert von 20–40 bp liegt14. Dies deutet darauf hin, dass die anfängliche Vervielfältigung in unseren entwickelten Populationen wahrscheinlich über nicht homologe Endverbindungen oder alternative Endverbindungen erfolgte, über die bei S. aureus bisher nicht berichtet wurde60.

DNA-Brüche tragen zur Bildung genomischer Amplifikationen bei, sowohl in Bakterien als auch in eukaryotischen Systemen14,61. DNA-Gyrase- und Topoisomerase-IV-Enzyme bauen topologischen Stress in der DNA ab und erzeugen kurzlebige DNA-Doppelstrangbrüche, die dann erneut ligiert werden. Fluorchinolone binden typischerweise DNA-Gyrase oder Topoisomerase IV in einem Komplex mit DNA und können sowohl die DNA-Spaltung fördern als auch die Religation der DNA-Enden stark hemmen, was zu vermehrten DNA-Doppelstrangbrüchen führt62,63. Fluorchinolon-Antibiotika können daher die Bildung genomischer Amplifikationen fördern, und in unserer Studie beobachteten wir eine allgegenwärtige Erzeugung und Selektion von sdrM-haltigen genomischen Amplifikationen bei DLX-Exposition. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte auch, dass die Exposition gegenüber dem DNA-Gyrase-Gift Albicidin, das auch die DNA-Religation blockiert,64 zu genomischen Amplifikationen eines Inhibitorproteins in Salmonella Typhimurium und Escherichia coli führte und zu einer Albicidin-Resistenz führte, was weiter darauf hindeutet, dass die Hemmung von DNA-Topoisomerase-Enzymen dabei helfen kann Bildung genomischer Amplifikationen65.

Es wird angenommen, dass Multi-Target-Antibiotika oder Medikamentenkombinationen die Häufigkeit von Antibiotikaresistenzen verringern. Unsere Studie zeigt jedoch, dass, wenn eines der Ziele solcher Behandlungen das DNA-Gyrase- oder Topoisomerase-Enzym ist, es stattdessen möglicherweise auf Genamplifikationen selektiert, die aufgrund von Brüchen in der DNA entstehen und zu einer schnellen Resistenzentwicklung führen, und diese Amplifikationen können auch zu weiteren unvorhergesehenen Folgen für die Fitness führen, einschließlich Kreuzresistenzen. Ein besseres Verständnis der genetischen und umweltbedingten Faktoren, die genomische Amplifikationen beeinflussen, sowie der adaptiven Trajektorien, die durch die Auswahl solcher Amplifikationen, insbesondere im klinischen Umfeld, zugänglich sind, ist daher notwendig, um neue antimikrobielle Therapien zu entwickeln.

Alle in dieser Arbeit verwendeten Stämme und Plasmide sind in der Ergänzungstabelle 1 beschrieben. Die klinischen Isolate wurden vom Cystic Fibrosis Foundation Isolate Core am Seattle Children's Hospital bezogen und ursprünglich von zwei verschiedenen Mukoviszidose-Patienten isoliert. Die Verteilung dieser Isolate wird durch ein von Seattle Children's genehmigtes IRB-Protokoll Nr. 14977 abgedeckt.

Alle Experimente in flüssigen Medien wurden bei 37 °C unter Schütteln mit 300 U/min in modifizierten M63-Medien (13,6 g/L KH2PO4, 2 g/L (NH4)2SO4, 0,4 μM Eisencitrat, 1 mM MgSO4; pH-Wert angepasst) durchgeführt 7,0 mit KOH), ergänzt mit 0,3 % Glucose, 0,1 μg/ml Biotin, 2 μg/ml Nikotinsäure, 1× Supplement EZ (Teknova) und 1× ACGU-Lösung (Teknova), oder in Mueller Hinton Broth 2 (MH2) (Millipore Sigma) mit oder ohne 1× ACGU. Zur Klonierung und Stammkonstruktion wurden Stämme in LB-Flüssigmedium (10 g/L Bacto-Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L NaCl) oder auf LB-Platten (mit 15 g/L Agar) gezüchtet, ergänzt mit das entsprechende Antibiotikum (10 µg/ml Chloramphenicol, 50 µg/ml Ampicillin, 10 µg/ml Trimethoprim) oder 0,4 % para-Chlorphenylalanin (PCPA) zur Gegenselektion. MH2-Platten wurden mit MH2-Agar (Millipore Sigma) hergestellt und entsprechend mit 1 × ACGU und DLX (entweder 0,5, 1 oder 2 μg/ml) ergänzt.

Zehn unabhängige Populationen von S. aureus JE2-Zellen wurden unter Schütteln bei 300 U/min bei 37 °C in modifizierten M63-Medien in Gegenwart steigender DLX-Konzentrationen mit einer täglichen 50–100-fachen Verdünnung in 14-ml-Röhrchen mit Schnappdeckel gezüchtet 2 ml frisches Medium mit DLX. Die Entwicklung begann zwischen 0,05–0,25 μg/ml DLX und die Konzentration wurde bei jeder Exposition um das 1,5–2-fache erhöht. Wenn die Stämme bei der Ausgangskonzentration nicht wuchsen, wurde eine niedrigere DLX-Konzentration gewählt, um die Evolution einzuleiten. Wenn eine Population während der Evolution nach einem Tag kein sichtbares Wachstum zeigte, wurde ihr ein zusätzlicher Wachstumstag zugestanden. Wenn es nach zwei Tagen immer noch kein Wachstum gab, wurde die Entwicklung auf die vorherige Passage zurückgesetzt und für die nachfolgende Passage wurde ein kleineres DLX-Inkrement gewählt. Die Evolution wurde entweder bei 128 μg/ml oder bei jeder Passage nach 8 μg/ml gestoppt, wenn die Populationen in der nachfolgenden Konzentration in zwei Versuchen nicht wuchsen. Einzelheiten zu den Populationen finden Sie im Ergänzungsdatensatz 1.

Ein ähnlicher Aufbau wurde zur Entwicklung der sdrM::Tn-Mutante verwendet, wobei jeweils drei unabhängige Populationen von sdrM::Tn und WT parallel entwickelt wurden, beginnend bei einer DLX-Konzentration von 0,1 μg/ml, und die Konzentrationen um 1,5–2 erhöht wurden -Falten Sie bei jeder Belichtung. In ähnlicher Weise wurden für die Entwicklung der klinischen Isolate drei unabhängige Populationen von CF001 und CF106 parallel entwickelt, beginnend bei einer DLX-Konzentration von 0,1 μg/ml für CF001 und 0,002 μg/ml für CF106. Die Konzentrationen wurden bei jeder Exposition um das 1,5- bis 2-fache erhöht. Die Evolution wurde wie oben beschrieben gestoppt.

Jede der zehn unabhängig voneinander entwickelten Populationen aus der ursprünglichen Evolution wurde mit P1–P10 gekennzeichnet. Daher bezeichnet P1 die erste unabhängig entwickelte Population. Wir führen einen Punkt und eine zweite Zahl ein, die die Durchgangsnummer darstellt. Beispielsweise gibt P1.7 den 7. Durchgang der ersten entwickelten Population an. Die Buchstaben am Ende jeder Zahl weisen darauf hin, dass es sich um ein Isolat handelte. Beispielsweise weist 1.7a auf ein aus der Population P1.7 extrahiertes Isolat hin. Die Isolate aus der letzten Passage werden als Populationszahl und ein Buchstabe dargestellt, zum Beispiel ist 1a ein Isolat aus der letzten Passage in Population P1.

Genomische DNA wurde aus ausgewählten Populationen und Isolaten mit dem Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit hergestellt. Anschließend wurden indizierte Single-End- oder Paired-End-Bibliotheken mit dem DNA-Bibliotheksvorbereitungskit Illumina Nextera XT vorbereitet und entweder auf einem Illumina MiSeq- oder Nextseq 500-Sequenzierer sequenziert. Die Daten wurden wie zuvor beschrieben66,67 analysiert, wobei die Illumina-Adapter mit Cutadapt v4.068 entfernt wurden, die Lesevorgänge mit Trimmomatic v0.3969 getrimmt wurden oder beide Schritte mit Fastp v0.23.267 durchgeführt wurden und die Mutationen in den entwickelten Populationen und Isolate wurden mit breseq v0.37.170 identifiziert. Die Mutationen, die in den entwickelten Populationen in Genen identifiziert wurden, die die kanonischen Ziele oder Effluxpumpen im Vergleich zum Elternstamm codieren, sowie alle in den Populationen vorhandenen Mutationen aus der Endpassage jeder unabhängig entwickelten Population sind im Ergänzungsdatensatz 2 aufgeführt. Identifizierte Mutationen in als vorhanden galt eine Population mit einer Häufigkeit von mindestens 30 %.

Die Genome der klinischen Isolate CF001 und CF106 wurden mit Unicycler v0.4.871 auf PATRIC72 zusammengestellt (jetzt in das Bacterial and Viral Bioinformatics Resource Center integriert). Die zusammengestellten Contigs wurden dann mit Prokka v1.14.673 kommentiert. Diese annotierten Genome wurden als Referenz verwendet, um Mutationen in den jeweiligen entwickelten Populationen mithilfe von breseq zu identifizieren.

MLST von CF001 und CF106 wurde mithilfe der Online-Datenbank PubMLST (pubmlst.org)74 durchgeführt, und die SCCmec-Typisierung erfolgte mit Staphoopia-sccmec75.

Die Abdeckungstiefe jedes Basenpaars in den Sequenzierungsdaten des gesamten Genoms wurde mit dem Befehl BAM2COV in breseq v0.37.1 bestimmt. Die Abdeckung aller Basenpaare wurde für das gesamte Genom oder jedes interessierende Gen summiert und dann durch die Sequenzlänge (Anzahl der Basenpaare) dividiert. Die fache Änderung der Abdeckung wurde dann bestimmt, indem die entsprechende Anzahl von Lesevorgängen pro Basenpaar des Gens durch die des gesamten Genoms dividiert wurde. Um sdrM-Amplifikationen zu identifizieren, mussten die Proben eine genomische Verbindung aufweisen, die zur sdrM-Amplifikation führte (wie durch breseq bestimmt) und einen Schwellenwert für die relative Leseabdeckung von sdrM erfüllen. Bei Isolaten musste die relative sdrM-Abdeckung mindestens das Zweifache des mittleren WT-Werts (aus drei biologischen Replikaten) betragen, während bei Populationen die relative sdrM-Abdeckung mindestens das 1,3-fache der mittleren WT-Abdeckung betragen musste (um die Population zu berücksichtigen). Heterogenität). Für jeden Amplifikationstyp wurde mindestens eine Instanz durch PCR-Amplifikation der neuen Verbindung und anschließende Sanger-Sequenzierung verifiziert.

Für die in der ergänzenden Abbildung 9 gezeigten Daten haben wir die normalisierte Abdeckung von sdrM, lmrS, sepA und rpoC als Summe der Lesevorgänge berechnet, die dem Gen zugeordnet wurden, dividiert durch die Genlänge. Die normalisierte Abdeckung der Effluxpumpe wurde dann durch die von rpoC dividiert und für jedes entwickelte Isolat auf den WT-Wert normalisiert, um die fache Änderung der Abdeckung zu erhalten.

Bei den klinischen Isolaten haben wir beim Zusammenfügen der Genome zu Contigs die Abdeckung von sdrM mit dem Contig verglichen, der es enthält. Die Bedeckungstiefe jedes Basenpaars im Contig wurde wie oben bestimmt. Die fache Änderung der sdrM-Abdeckung wurde bestimmt, indem die Anzahl der Lesevorgänge pro Basenpaar von sdrM durch die des Contig dividiert wurde. Die Kriterien zur Identifizierung einer Amplifikation waren die gleichen wie oben, mit der Ausnahme, dass die relative Abdeckung von sdrM mit dem Wert des jeweiligen klinischen Elternisolats verglichen wurde.

Genomische DNA wurde aus entwickelten Isolaten extrahiert, und die entwickelten Allele wurden durch PCR amplifiziert und in mit BamHI und EcoRI verdautes pIMAY* unter Verwendung der Gibson-Assembly76 kloniert. Das Methylierungsprofil der Plasmide wurde nach Elektroporation und Extraktion der konstruierten Plasmide aus E. coli IM08B77 an S. aureus angepasst. Die Plasmidextraktion erfolgte mit dem Qiagen Plasmid MIDI Kit und die Plasmide wurden mit Savant SpeedVac SPD1030 konzentriert. Der Allelaustausch wurde in S. aureus JE2 wie beschrieben durchgeführt76. Kurz gesagt, Plasmide wurden in S. aureus JE2-Zellen elektroporiert und bei 30 °C auf LB-Agar + Chloramphenicol ausplattiert. Transformierte Kolonien wurden zwei Nächte lang unter Schütteln bei 37 °C in LB-Medium + Chloramphenicol gezüchtet, mit einer 1:1000-Verdünnung in frischem Medium nach der ersten Nacht. Am folgenden Tag wurden die Zellen auf LB-Agar + Chloramphenicol ausplattiert und die Kolonien wurden durch PCR mit den in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführten Integrationsprimern auf Integration getestet. Zur Plasmidentfernung wurden Kolonien, die eine Integration zeigten, in LB-Medium bei 25 ° C unter Schütteln gezüchtet zwei Nächte, mit einer 1:1000-fachen Verdünnung nach der ersten Nacht. Anschließend wurden die Zellen auf LB-Platten mit 0,4 % PCPA ausplattiert und die Kolonien anhand ihrer Größe gescreent, wobei größere Größen als Hinweis auf eine Plasmidexzision angenommen wurden. 60–100 große Kolonien wurden auf LB-Platten mit und ohne Chloramphenicol ausgestrichen, um Chloramphenicol-empfindliche Klone zu identifizieren. Das Vorhandensein des mutierten Allels wurde durch Sanger-Sequenzierung unter Verwendung der Sequenzierungsprimer bestätigt (siehe Ergänzungstabelle 2).

Genomassemblierungen von 63.986 S. aureus-Isolaten wurden aus der NCBI Pathogen Detection-Datenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/) heruntergeladen, auf die am 19. Januar 2023 zugegriffen wurde. Die FASTA-Sequenzen wurden verkettet und a Die lokale BLAST-Datenbank wurde mit dem NCBI BLAST v2.13.0+ makeblastdb-Befehl78 erstellt. Die Proteinsequenz der JE2-SdrM-Sequenz wurde als Abfrage für eine tblastn-Suche (übersetzt BLAST) in der lokalen Datenbank verwendet, und die Ausgabe wurde auf alle Treffer analysiert, die eine Abdeckung von 100 %, eine prozentuale Identität >85 % und einen E-Wert aufwiesen < 10−6. Die Aminosäurehäufigkeiten für alle Positionen wurden anhand der tblastn-BTOP-Ausgabe quantifiziert und sind im Ergänzungsdatensatz 3 aufgeführt.

Um die Überexpressionsstämme zu konstruieren, wurden WT-Gene und sdrM-mutierte Allele durch PCR amplifiziert und unter Verwendung der Gibson-Assemblierung in den PCR-amplifizierten pKK30-Vektor kloniert. Das von Gibson zusammengesetzte Produkt wurde in elektrokompetente E. coli DH5α λ-pir-Zellen elektroporiert und auf LB-Agar + Trimethoprim-Platten gewonnen. Plasmide wurden aus den E. coli-Stämmen extrahiert und in S. aureus RN4220 elektroporiert. Plasmide wurden noch einmal extrahiert und in S. aureus JE2 elektroporiert.

Die Zellen wurden 16 Stunden lang in 2 ml M63 gezüchtet. 2 µl dieser Zellen wurden zu 198 µl M63 + 0,1 µg/ml DLX in einer 96-Well-Platte gegeben. Die Fluoreszenz von DLX (Anregungs- und Emissionswellenlängen von λexc = 395 nm bzw. λem = 450 nm) und die OD600 wurden 19,5 Stunden lang alle 30 Minuten gemessen. Hintergrundmessungen wurden für Zellen in M63 ohne DLX oder 0,1 µg/ml DLX und für M63 allein ohne DLX oder 0,1 µg/ml DLX durchgeführt. Da die Rohfluoreszenz nur in Gegenwart von Zellen beobachtet wurde (ergänzende Abbildung 4a), deutet dies wahrscheinlich auf eine DLX-Anreicherung in Zellen hin und kann als Proxy für intrazelluläres DLX verwendet werden. Um einen Vergleich zwischen den Proben zu ermöglichen, normalisierten wir die Fluoreszenz für die Zelldichte und subtrahierten die Autofluoreszenz der Medien und Zellen. Die normalisierte Fluoreszenz (Fluoreszenz/OD600) wurde berechnet als:

Da die Zelldichte anfangs sehr niedrig ist und sich die Zellen in der Verzögerungsphase befinden, weist die normalisierte Fluoreszenz zu den frühen Zeitpunkten aufgrund der niedrigen Werte der Nennerterme eine hohe Variabilität auf. Daher zeigen wir in den Abbildungen die Daten der letzten 12,5 Stunden.

Um die DLX-Ausflussraten zu bestimmen, haben wir ein vereinfachtes mathematisches Modell in Betracht gezogen, um nur den Anstieg der DLX-Konzentration innerhalb der Zellen zu erfassen. Angesichts der Auswahl von sdrM-Mutationen und der Auswirkung der sdrM-Überexpression auf die DLX-Resistenz gingen wir davon aus, dass der DLX-Efflux hauptsächlich von der SdrM-Aktivität abhängt. Da es sich bei SdrM außerdem um eine Effluxpumpe handelt und es unwahrscheinlich ist, dass sie den DLX-Metabolismus oder -Abbau beeinflusst, sollten diese Prozesse bei unseren getesteten Stämmen ähnlich sein und wir haben sie daher nicht in unser Modell einbezogen. Wir haben die folgenden Differentialgleichungen definiert:

Dabei ist Cin die DLX-Konzentration innerhalb der Zelle zum Zeitpunkt t, ρin die Einströmgeschwindigkeit von DLX in die Zelle, Cout die DLX-Konzentration außerhalb der Zelle zum Zeitpunkt t, ρout die Ausströmgeschwindigkeit von DLX die Zelle und A = Cout (t = 0) ist die anfängliche DLX-Konzentration, die wir für das Experiment verwendet haben, 0,1 µg/ml (~0,226 µM). Wir gingen davon aus, dass die DLX-Bindung und -Entbindung sehr schnell erfolgt, und berücksichtigen dies der Einfachheit halber nicht in unseren Gleichungen. Wenn wir die beiden obigen Gleichungen lösen, erhalten wir:

Wenn wir diese lineare gewöhnliche Differentialgleichung zweiter Ordnung mit Cin (t = 0) = 0 integrieren, erhalten wir:

wobei B eine beliebige Konstante ist. Da die normalisierte Fluoreszenz, die wir mit dem Efflux-Assay ermittelt haben, ein Proxy für Cin war, führten wir eine Anpassung der kleinsten Quadrate von Cin mit der normalisierten Fluoreszenz gegen die Zeit für sdrM::Tn durch, um B und ρin zu bestimmen, unter der Annahme, dass die Effluxrate dies tun wird gleich der Zustromrate sein, ρin = ρout für den Transposon-Mutanten, da SdrM fehlt und der Transport von DLX in die Zelle hinein und aus ihr heraus passiv ist. Es wurde angenommen, dass die am besten geeigneten Werte für B und ρin für die anderen Stämme gleich sind. Durch Ersetzen dieser Werte führten wir eine Anpassung der kleinsten Quadrate für WT, sdrM1*, sdrM2* und sdrM3* durch, um die besten Anpassungswerte für die Effluxraten ρout für jeden Stamm zu bestimmen. Als wir Cin an die normalisierte Fluoreszenz anpassten, waren die Einheiten der Einström- und Ausströmraten willkürliche Einheiten/Zeit (Stunden).

DLX wurde seriell zweifach in einer Corning 96-Well-Platte mit flachem, klarem Boden verdünnt, um acht Konzentrationen zu erhalten. Über Nacht in M63-Medium oder Mueller-Hinton-Bouillon 2 (MH2) gezüchtete Zellen wurden mit einer Endverdünnung von 1:5000 auf die 96-Well-Platte mit dem seriell verdünnten Antibiotikum übertragen und 24 Stunden lang bei 37 °C unter Schütteln gezüchtet. Nach dem Wachstum wurde der OD600 aller Wells mit einem Biotek Synergy H1-Mikroplattenlesegerät gemessen. Die OD600-Messungen für alle DLX-Konzentrationen wurden gegen die DLX-Konzentrationswerte aufgetragen und an eine modifizierte Gompertz-Funktion angepasst, um die genauen MHK-Werte zu bestimmen79. Um die Multidrug-MICs zu bestimmen, wurde WT in MH2-Brühe, ergänzt mit 1× ACGU, gezüchtet, und 1.7a wurde in MH2, ergänzt mit 1× ACGU, mit oder ohne 2 µg/ml DLX über Nacht gezüchtet. Am folgenden Tag wurden alle drei Übernachtungen zweimal in 1 × PBS gewaschen und die MHK für alle Antibiotika bestimmt. Für Experimente mit 1.7a wurde das MH2-Medium mit 1× ACGU ergänzt, da pyrC, ein Gen, das an der Pyrimidinsynthese beteiligt ist, eine Frameshift-Mutation in 1.7a aufwies, was zu einem schlechten Wachstum ohne 1× ACGU-Supplementierung führte.

Genomische DNA wurde wie oben beschrieben extrahiert. RNA wurde aus über Nacht in M63 gezüchteten Zellen mit dem Total RNA Purification Plus Kit (Norgen Biotek Corp) extrahiert und DNA wurde mit dem TURBO DNA-free™ Kit (Invitrogen) entfernt. cDNA wurde unter Verwendung von Zufallsprimern und Superscript III Reverse Transkriptase (Thermo Fisher Scientific) synthetisiert. Genomische DNA- oder cDNA-Proben wurden mit Primern (siehe Ergänzungstabelle 2) und Applied Biosystems Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Scientific) in einer Microamp EnduraPlate Optical 384 Well Clear Reaction Plate (Thermo Fisher Scientific) und der qPCR oder RT-qPCR gemischt wurde jeweils auf einem QuantStudio 5 Echtzeit-PCR-Gerät (Thermo Fisher Scientific) ausgeführt. Das rpoC-Gen wurde als Haushaltskontrolle sowohl für die qPCR als auch für die RT-qPCR80 verwendet.

Zwölf unabhängige Kolonien für jeden Stamm wurden in einer Platte mit 96 Vertiefungen, die 200 μl frisches M63 enthielt, bei 37 °C unter 24-stündigem Schütteln inokuliert. Am nächsten Tag wurden jeweils 10 μl in 190 μl frisches M63 geimpft, das das 2,5-fache der jeweiligen DLX-MICs enthielt (sdrM::Tn bei 0,32 μg/ml, WT bei 0,55 μg/ml, sdrM1* und sdrM2* bei 1 μg/ml). ml und sdrM3* bei 1,75 μg/ml) und 23 Stunden lang bei 37 °C unter Schütteln gezüchtet. Nach 23 Stunden wurde die OD600 gemessen und 10 μl jeder Vertiefung in eine Platte mit 96 Vertiefungen überführt, die 190 μl frisches M63 und DLX enthielt, und dies wurde 5–14 Tage lang wiederholt. Für die Entwicklung der WT- und sdrM::Tn-Stämme (Daten in Abb. 5e dargestellt) wurden die Populationen nach Tag 5 weitere 24 Stunden ohne Transfer gezüchtet, um möglicherweise zusätzliches Wachstum und weitere Entwicklung zu ermöglichen und Vergleiche zwischen ihnen zu ermöglichen zwei Stämme. Populationen, die eine OD600 ≥ 0,400 aufwiesen und dieses Wachstum bis zum Ende des Experiments konstant aufrechterhielten, wurden als resistent eingestuft. Das Experiment wurde abgebrochen, wenn an drei aufeinanderfolgenden Tagen in keiner der Vertiefungen Wachstum zu verzeichnen war.

Am ersten Tag wurden die Stämme in frisches M63-Medium geimpft und 24 Stunden lang bei 37 °C unter Schütteln ohne DLX gezüchtet. Am zweiten Tag wurden die Zellen 1000-fach in Röhrchen verdünnt, die frisches Medium ohne Antibiotika oder DLX in den entsprechenden Konzentrationen enthielten. Der gleiche Vorgang wurde am dritten Tag wiederholt, und für jeden Stamm gab es zwei Wiederholungen. Jeden Tag wurde genomische DNA extrahiert und eine Sequenzierung des gesamten Genoms durchgeführt. Die sdrM-Kopienzahl wurde wie oben beschrieben bestimmt.

Die Zellen wurden über Nacht in MH2-Brühe, ergänzt mit 1 × ACGU, gezüchtet, und am folgenden Tag wurden Reihenverdünnungen der Kulturen auf MH2-Agarplatten, ergänzt mit 1 × ACGU, ohne DLX, oder mit 2 μg/ml DLX, 1 μg, getüpfelt /ml oder 0,5 μg/ml und über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C gezüchtet. Am darauffolgenden Tag wurden die koloniebildenden Einheiten bestimmt.

Die Zellen wurden über Nacht in M63 gezüchtet, 1:2500 in frischem M63 verdünnt und 200 µl wurden in eine Platte mit 96 Vertiefungen überführt. Die Platten wurden in einem Biotek Synergy H1-Mikroplattenlesegerät bei 37 °C unter kontinuierlichem Schütteln mit 807 Zyklen pro Minute inkubiert und der OD600 der Platte 24 Stunden lang alle 30 Minuten gemessen. Zur Bestimmung der Zelldichte wurden Reihenverdünnungen von Übernachtkulturen auf LB-Agarplatten aufgetragen und über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C gezüchtet. Am darauffolgenden Tag wurden die koloniebildenden Einheiten bestimmt.

Statistische Tests und Analysen wurden in GraphPad Prism v8.4.3 durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Genomassemblierungen von S. aureus-Isolaten zur Analyse der Allelvariabilität von SdrM wurden aus der NCBI Pathogen Detection-Datenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/) heruntergeladen. Die Daten zur Sequenzierung des gesamten Genoms aus dieser Studie wurden im NCBI Short Read Archive (SRA) hinterlegt, das mit dem BioProject PRJNA904786 verbunden ist. Quelldaten werden in diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir möchten dem Center for Cancer Research Genomics Core für die Vorbereitung und Sequenzierung der Sequenzierungsbibliothek des gesamten Genoms sowie dem Bose-Labor (University of Kansas Medical Center) für die Bereitstellung des pKK30-Plasmids danken. Wir danken Tiffany Zarrella für die Sequenzierung und Zusammenstellung der Genome der klinischen Isolate sowie für die Unterstützung bei der SCCmec-Typisierung. Wir danken Susan Gottesman, Gigi Storz, John Dekker und Mitgliedern des Khare-Labors für Kommentare zum Manuskript sowie Mitgliedern der Gottesman-, Ramamurthi- und Khare-Labors für Diskussionen und Vorschläge während dieser Arbeit. Diese Studie nutzte die Rechenressourcen des NIH High-Performance Computing Biowulf-Clusters (http://hpc.nih.gov). Diese Arbeit wurde vom Intramural Research Program des NIH, dem National Cancer Institute und dem Center for Cancer Research unterstützt.

Open-Access-Förderung durch die National Institutes of Health (NIH).

Labor für Molekularbiologie, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 20892, USA

Kalinga Pavan T. Silva, Ganesh Sundar und Anupama Khare

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GS führte die ursprünglichen Evolutionsexperimente durch, KPTS führte alle anderen Experimente durch, KPTS und AK analysierten Daten und verfassten das Manuskript, AK überwachte die Forschung.

Korrespondenz mit Anupama Khare.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Tobias Bollenbach, Theresa Fink und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Silva, KPT, Sundar, G. & Khare, A. Efflux-Pump-Genamplifikationen umgehen die Notwendigkeit mehrerer Zielmutationen für eine Resistenz gegen Dual-Targeting-Antibiotika. Nat Commun 14, 3402 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38507-4

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Eingegangen: 07. Dezember 2022

Angenommen: 05. Mai 2023

Veröffentlicht: 09. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38507-4

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