Auswirkungen der Reihenfolge der Exposition gegenüber antimikrobiellen Mitteln auf die Inzidenz von Multidrogen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 8826 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Multiresistenter Pseudomonas aeruginosa (MDRP) ist einer der wichtigsten Krankheitserreger in der klinischen Praxis. Um die Mechanismen zu klären, die zu seiner Entstehung beitragen, haben wir MDRPs mithilfe des P. aeruginosa PAO1 isoliert, dessen gesamte Genomsequenz bereits aufgeklärt wurde. Mutantenstämme, die gegen Carbapeneme, Aminoglykoside und neue Chinolone resistent sind und zur Behandlung von P. aeruginosa-Infektionen eingesetzt werden, wurden isoliert; jedoch erfüllte keines die Kriterien für MDRPs. Dann wurden PAO1-Stämme diesen antimikrobiellen Wirkstoffen in unterschiedlicher Reihenfolge ausgesetzt und die Häufigkeit des Auftretens von MDRP variierte je nach Expositionsreihenfolge; MDRPs traten häufiger auf, wenn Gentamicin vor Ciprofloxacin angewendet wurde, wurden jedoch selten isoliert, wenn Ciprofloxacin zuerst angewendet wurde. Die Exposition gegenüber Ciprofloxacin, gefolgt von Gentamicin, erhöhte aufgrund der NfxB-Mutation die Expression von MexCD-OprJ, einer Multidrug-Effluxpumpe vom RND-Typ. Im Gegensatz dazu führte die Exposition gegenüber Gentamicin gefolgt von Ciprofloxacin zu mehr Mutationen in der DNA-Gyrase. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Art des Chinolon-Resistenzmechanismus mit der Häufigkeit von MDRP zusammenhängt und dass das Risiko einer MDRP-Inzidenz stark von der Reihenfolge der Exposition gegenüber Gentamicin und Ciprofloxacin abhängt.

Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistischer Erreger, der eine hohe intrinsische Resistenz gegen antimikrobielle Wirkstoffe aufweist. P. aeruginosa kann durch unsachgemäße Verwendung und/oder langfristige Verabreichung antimikrobieller Wirkstoffe eine Resistenz entwickeln. Viele multiresistente P. aeruginosa-Stämme (MDRPs) wurden identifiziert und weisen eine hohe Resistenz gegen drei antimikrobielle Wirkstoffe auf, nämlich Breitband-β-Lactame, Aminoglykoside und Fluorchinolone1,2,3. Da die Zahl der gegen MDRP wirksamen Antibiotika begrenzt ist, sind Gegenmaßnahmen wichtig.

Um den angemessenen Einsatz antimikrobieller Wirkstoffe zu fördern, ist es wichtig, den Zusammenhang zwischen den verwendeten antimikrobiellen Wirkstoffen und den Mechanismen zu klären, die der Entstehung von Resistenzen zugrunde liegen. Die Analyse klinischer Isolate hat in den letzten Jahren Fortschritte gemacht, was zu einem detaillierteren Verständnis der MDRPs1,2,3 geführt hat. Es ist jedoch unmöglich, den Elternstamm eines isolierten MDRP im klinischen Umfeld zu finden, da der anfällige Elternstamm nach der Isolierung des MDRP bereits verschwunden ist. Daher können Analysen klinisch isolierter MDRPs allein keinen direkten Zusammenhang zwischen der Art des bei der Behandlung verwendeten antimikrobiellen Mittels und dem Mechanismus erkennen, der der Resistenzbildung dagegen zugrunde liegt.

In der vorliegenden Studie haben wir MDRPs mithilfe des Stammes P. aeruginosa PAO1 isoliert und analysiert, dessen gesamte genomische DNA-Sequenz verfügbar ist. Wir waren nicht in der Lage, MDRPs zu isolieren, wenn wir einem oder zwei antimikrobiellen Wirkstoffen ausgesetzt waren, waren aber mit einer aufeinanderfolgenden Exposition gegenüber drei antimikrobiellen Wirkstoffen erfolgreich. Daher entstanden MDRPs durch die Kombination mehrerer Resistenzmechanismen. Wir haben auch herausgefunden, dass die Reihenfolge, in der antimikrobielle Mittel eingesetzt werden, die Entstehung von MDRPs beeinflussen kann.

Wir haben aus P. aeruginosa PAO1 arzneimittelresistente Mutanten für Carbenicillin (β-Lactame), Imipenem (Carbapeneme), Gentamicin und Amikacin (Aminoglykoside) sowie Ciprofloxacin und Levofloxacin (Fluorchinolone) isoliert, die zur klinischen Behandlung von P. aeruginosa-Infektionen eingesetzt werden Einstellungen. Die Häufigkeit des Auftretens resistenter Mutanten betrug 7,5×10−7 bis 1,1×10−8 (Tabelle 1).

Unter 540 Mutanten wurde das Spektrum der Antibiotikaresistenz bei 92 zufällig ausgewählten Mutanten untersucht. Diese Mutanten wurden anhand des Spektrums in sieben Gruppen eingeteilt (Tabelle 2). 68 Mutanten zeigten eine Mehrfachresistenz (Gruppen 1–3). In diesen Gruppen war das Arzneimittelresistenzspektrum gleich oder ähnlich dem Substratmuster von Effluxpumpen vom RND-Typ4,5,6,7. In einigen Mutanten jeder Gruppe wurde die Expression von Effluxpumpengenen vom RND-Typ mittels RT-PCR untersucht. Die Expression von mexA war in Mutanten der Gruppe 1 hochreguliert (Abb. 1A). Die Expression von mexC wurde in Mutanten der Gruppe 2 beobachtet, wurde jedoch in PAO1 nicht nachgewiesen (Abb. 1B). Die Expression von mexX wurde in den Gruppen 3 und 4 hochreguliert (Abb. 1C). Da die als Gruppe 5 klassifizierten Mutantenstämme nur gegen Carbenicillin resistent waren, wird vermutet, dass AmpC-β-Lactamase in diesen Stämmen stark exprimiert wird8. In Gruppe 6 wurde nur eine Imipenem-Resistenz beobachtet und es wurde über eine herunterregulierte Expression des Außenmembranporins OprD spekuliert9,10. Mutanten der Gruppe 7 zeigten eine Resistenz gegen Ciprofloxacin und Levofloxacin, was auf eine Mutation in der DNA-Gyrase oder Topoisomerase IV11 hinweist. Anders als die Imipenem-Mutanten zeigten die meisten Mutanten eine Multiresistenz, was auf eine hochregulierte Expression von Multidrug-Effluxpumpen hindeutet. Mit diesem Verfahren wurde jedoch kein Mutant isoliert, der als MDRP gilt (MHK für Imipenem: 16 μg/ml oder höher, Amikacin: 32 μg/ml oder höher, Ciprofloxacin: 4 μg/ml oder höher).

Expression von Multidrug-Efflux-Pump-Genen vom RND-Typ. (A) Oberes Feld: mexA, unteres Feld: rpsL (interne Kontrolle), M: Marker (pUC19/MspI), 1: PAO1, 2: CAR204, 3: CAR401, 4: LV201, 5: LV206, 6: LV438. (B) Oberes Feld: mexC, Unteres Feld: rpsL (interne Kontrolle), M: Marker (pUC19/MspI), 1: PAO1, 2: CIP101, 3: CIP126, 4: IC4430, 5: IC4404, 6: LV235, 7: LV801. (C) Oberes Feld: mexX, unteres Feld: rpsL (interne Kontrolle), M: Marker (pUC19/MspI), 1: PAO1, 2: AMK1606, 3: AMK1612, 4: GM458. (D) Oberes Feld: mexX, Unteres Feld: rpsL (interne Kontrolle), M: Marker (pUC19/MspI), 1: PAO1, 2: GM458, 3: IG4455, 4: CG4401, 5: CG4411, 6: CgG4479, 7: ICG444391, 8: ICG444242, 9: CIG44408. (E) Oberes Feld: mexX, unteres Feld: rpsL (interne Kontrolle), M: Marker (pUC19/MspI), 1: PAO1, 2: CgIG44441. Die weiße gestrichelte Linie zeigte einen Ausschnitt aus einem Foto der Elektrophorese. Rohdaten wurden in den Zusatzdaten angezeigt.

Da die Häufigkeit der Isolierung eines Antibiotikums zwischen 10–7 und 10–8 lag, waren Schwierigkeiten mit der direkten Isolierung von MDRPs aus PAO1 nach Exposition gegenüber einem Arzneimittel verbunden. Daher gingen wir davon aus, dass MDRPs durch aufeinanderfolgende Exposition gegenüber drei Arzneimitteln isoliert werden können.

Da MDRPs nicht durch die Exposition gegenüber nur einem Medikament isoliert wurden, haben wir versucht, MDRPs durch eine aufeinanderfolgende Exposition gegenüber drei verschiedenen Medikamenten zu isolieren (Abb. 2). IPM429, GM458, CIP101, CIP126 und CIP131 wurden nach der ersten Exposition als Mutanten verwendet. Die IPM429-Mutante zeigte eine erhöhte MHK für Imipenem und das Porinprotein OprD wurde nicht nachgewiesen (Tabelle 3, Abb. 3). Da einige Gentamicin-resistente Mutanten einen instabilen Resistenzphänotyp aufweisen, wurden weitere Analysen mit GM458-Mutanten durchgeführt, die eine stabile Resistenz gegen Gentamicin aufwiesen. GM458 zeigte eine erhöhte MHK für Gentamicin, Amikacin, Ciprofloxacin und Levofloxacin (Tabelle 3) sowie die hochregulierte Expression von mexX, einem Bestandteil des Multidrug-Efflux-Transporters MexXY-OprM vom RND-Typ (Abb. 1C). Es wurden zwei Arten von Ciprofloxacin-resistenten Mutanten erhalten: Eine (CIP131) zeigte eine erhöhte MHK für Fluorchinolone (Ciprofloxacin und Levofloxacin), nur aufgrund einer Mutation in GyrA, einer Untereinheit der DNA-Gyrase (Tabelle 3, 5). Die anderen (CIP101 und CIP126) zeigten nicht nur Resistenzen gegen Fluorchinolone, sondern auch gegen Tetracycline, Chloramphenicol, Erythromycin und Acriflavin. Es wurde zuvor berichtet, dass diese Medikamente über den RND-Typ-Multidrug-Efflux-Transporter MexCD-OprJ4,12 exportiert werden, und es wurde eine hochregulierte Expression von mexCD-oprJ beobachtet (Abb. 1B). Im nächsten Schritt wurden die beiden CIP-Mutantentypen als Elternstamm verwendet. Mutanten wurden acht verschiedenen Arzneimittelsequenzen ausgesetzt.

Fluss des Erwerbs von Mutanten. Unter Verwendung von PAO1 als Elternstamm wurden zunächst resistente Mutanten von Gentamicin, Imipenem und Ciprofloxacin erhalten. Daraus wurde ein repräsentativer Stamm ausgewählt und dem zweiten antimikrobiellen Wirkstoff ausgesetzt, um einen resistenten Mutantenstamm zu erhalten. Auf die gleiche Weise wurde das dritte antimikrobielle Mittel ausgesetzt, um drei arzneimittelresistente Mutanten zu erhalten.

Western-Blot-Analyse von OprD. 1: PAO1, 2: IPM429, 3: GI4401, 4: CI4401, 5: CgI4401, 6: GCI48410, 7: CGI44201, 8: CgGI44405. Nach der Chemilumineszenzbehandlung wurden die Blots mit einem Gel-Bildgebungssystem sichtbar gemacht. Hier wurden nur die erforderlichen Spuren angezeigt. Rohdaten vor dem Trimmen wurden in den Zusatzdaten angezeigt.

GI-Mutanten wurden aus GM458 isoliert, das 4 μg/ml Imipenem ausgesetzt war. Fünf Mutanten zeigten nur für Imipenem eine erhöhte MHK (8- bis 32-fach) (Tabellen 3 und S1). Im repräsentativen GI4401 wurde das OprD-Protein in der Membranfraktion nicht nachgewiesen (Abb. 3). In diesem Stamm wurde eine Deletion von einem Nukleotid in der oprD-kodierenden Region beobachtet, die zu einer Frameshift-Mutation führte (Tabelle 4). Ciprofloxacin-resistente Mutanten wurden aus GI4401 isoliert, das 2 μg/ml Ciprofloxacin ausgesetzt war. Die MHK für Ciprofloxacin und Levofloxacin stieg in zehn zufällig ausgewählten Mutanten an (4- bis 16- bzw. 8- bis 16-fach) (Tabellen 3 und S1). Alle zehn Mutanten erfüllten die Kriterien für MDRP. Mit Ausnahme von GIC44805 wurden Mutationen in der Chinolonresistenz-bestimmenden Region (QRDR) von gyrA oder gyrB identifiziert. (Tabelle 5).

Wir haben Ciprofloxacin-resistente Mutanten (GC-Mutanten) aus GM458 isoliert, das 2 μg/ml Ciprofloxacin ausgesetzt war. Zehn der Mutanten zeigten eine erhöhte MHK für Ciprofloxacin und Levofloxacin, nicht jedoch für andere Arzneimittel (Tabellen 3 und S2). Dieses Ergebnis zeigte, dass es sich bei diesen Mutanten um DNA-Gyrase-Mutanten handelte, nicht jedoch um MexCD-OprJ-hochregulierte Mutanten. Alle Mutanten hatten eine Mutation im QRDR von gyrA (Tabelle 5). Imipenem-resistente Mutanten (GCI-Mutanten) wurden aus GC4801 isoliert, das 4 μg/ml Imipenem ausgesetzt war. Alle zehn GCI-Mutanten zeigten eine erhöhte Resistenz gegen Imipenem (16- bis 32-fache Steigerung als GC4801) (Tabelle 3). In GCI48410 wurde eine Insertionsmutation in oprD beobachtet, die zu einer Frameshift-Mutation führte (Tabelle 4), und das OprD-Protein wurde in der äußeren Membranfraktion nicht nachgewiesen (Abb. 3). Alle zehn GCI-Mutanten erfüllten die Kriterien für MDRP (Tabelle S2).

Ciprofloxacin-resistente Mutanten (IC-Mutanten) wurden isoliert, indem IPM429 1 μg/ml Ciprofloxacin ausgesetzt wurde. Zehn IC-Mutanten zeigten eine erhöhte MHK nicht nur für Fluorchinolone, sondern auch für Chloramphenicol, Erythromycin und Acriflavin (Tabellen 3 und S3). Die Hochregulierung von mexCD-oprJ schien stattgefunden zu haben. Bei sechs der zehn Mutanten war die MHK für Carbenicillin, Imipenem, Gentamicin und Amikacin verringert (Tabelle S3). Ein ähnliches Phänomen wurde für die nfxB-Mutante13,14 berichtet. Der mRNA-Spiegel von mexC war in IC4430 erhöht, wohingegen die MHK von Carbenicillin, Imipenem, Gentamicin und Amikacin unverändert blieben. In IC4404 waren die MHKs für Carbenicillin, Imipenem, Gentamicin und Amikacin verringert (Abb. 1B). Unter Verwendung von IC4430 wurden Gentamicin-resistente Mutanten (ICG-Mutanten) durch Exposition gegenüber 16 μg/ml Gentamicin isoliert. Alle zehn ICG-Mutanten zeigten eine signifikant erhöhte MHK für Gentamicin und Amikacin, während neun eine verringerte MHK für Imipenem, Ciprofloxacin, Levofloxacin, Tetracyclin, Chloramphenicol und Erythromycin zeigten (Tabellen 3 und S3). In ICG444391, das die MHK für Imipenem, Ciprofloxacin, Levofloxacin, Tetracyclin, Chloramphenicol und Erythromycin aufrechterhielt, wurde mexX in ICG444391 stark exprimiert (Abb. 1D). Nur ICG444391 erfüllte die Kriterien für MDRP.

Gentamicin-resistente Mutanten (IG-Mutanten) wurden aus IPM429 isoliert, das 16 μg/ml Gentamicin ausgesetzt war. Zehn Mutanten zeigten eine erhöhte Resistenz gegen Gentamicin und Amikacin (8- bis 16- bzw. 4- bis 8-fach) (Tabellen 3 und S4). Diese arzneimittelresistenten Muster deuteten auf eine hochregulierte Expression von mexXY hin; Es wurde jedoch festgestellt, dass drei Mutanten (IG4405, IG4427 und IG4485) mit einer Subkultur in Brühe ohne Antibiotika leicht zu den Expressionsniveaus des Elternstamms zurückkehren. Für nachfolgende Analysen haben wir IG4455 ausgewählt, das eine stabile Resistenz aufweist. In IG4455 wurde die Expression von mexX hochreguliert (Abb. 1D). Ciprofloxacin-resistente Mutanten (IGC-Mutanten) wurden aus IG4455 isoliert, das 2 μg/ml Ciprofloxacin ausgesetzt war. Zehn Mutanten zeigten eine erhöhte Resistenz gegen Ciprofloxacin und Levofloxacin (Tabelle S4), und die GyrB-Mutation wurde im QRDR (Ser466Phe) aller Mutanten identifiziert (Tabelle 5).

Die hochregulierte Expression von mexC wurde in CIP101 beobachtet (Abb. 1B). Gentamicin-resistente Mutanten (CG-Mutanten) wurden nach einer Exposition gegenüber 16 μg/ml Gentamicin isoliert. Zehn Mutanten zeigten eine erhöhte MHK für Gentamicin und Amikacin (8- bis 64-fach) (Tabellen 3 und S5). In CG4401 war die Expression von mexX hochreguliert (Abb. 1D). Imipenem-resistente Mutanten (CGI-Mutanten) wurden aus CG4401 mit 2 μg/ml Imipenem isoliert, und zehn Mutanten zeigten eine erhöhte MHK nur für Imipenem (8- bis 16-fach) (Tabellen 3 und S5). Das OprD-Protein wurde in der Membranfraktion von CGI44201 nicht nachgewiesen (Abb. 3). In der oprD-Kodierungsregion wurde eine große Deletion identifiziert (Tabelle 4). Alle zehn CGI-Mutanten wurden als Nicht-MDRP definiert, da die MHK für Imipenem unter 16 μg/ml lag.

Wir haben versucht, Imipenem-resistente Mutanten (CI-Mutanten) aus CIP101 zu isolieren, das 2 μg/ml Imipenem ausgesetzt war, waren jedoch aus unbekannten Gründen erfolglos. Allerdings wurden CI-Mutanten aus CIP126 isoliert, einem Mutanten mit hochregulierter Expression von mexC, der 4 μg/ml Imipenem ausgesetzt war. Alle zehn CI-Mutanten zeigten eine 16-fach höhere MHK für Imipenem (Tabellen 3 und S6). Das OprD-Protein wurde in der Membranfraktion von CI4401 nicht nachgewiesen (Abb. 3) und eine Nonsense-Mutation wurde in der oprD-kodierenden Region identifiziert (Tabelle 4). Gentamicin-resistente Mutanten (CIG-Mutanten) von CI4401, isoliert mit 16 μg/ml Gentamicin, zeigten eine erhöhte Resistenz gegen Gentamicin und Amikacin (Tabellen 3 und S6). Einer dieser Mutanten, CIG44408, zeigte die hochregulierte Expression von mexX (Abb. 1E). Drei der zehn CIG-Mutanten (CIG44402, CIG44404 und CIG44408) wurden als MDRPs kategorisiert.

CIP131 zeigte eine erhöhte Resistenz gegen Ciprofloxacin und Levofloxacin, was darauf hinwies, dass es sich um eine DNA-Gyrase-Mutante handelte. Wir haben eine Punktmutation (Thr83Ile) im QRDR von GyrA identifiziert (Tabelle 5). Mit 16 μg/ml Gentamicin isolierten wir Gentamicin-resistente Mutanten (CgG-Mutanten). Neun CgG-Mutanten zeigten eine höhere MHK als CIP131 für Gentamicin, Amikacin, Ciprofloxacin und Levofloxacin (Tabellen 3 und S7). Die hochregulierte Expression von mexX wurde in CgG4479 beobachtet (Abb. 1D). Imipenem-resistente Mutanten (CgGI-Mutanten) wurden aus CgG4479 isoliert, das 4 μg/ml Imipenem ausgesetzt war. Alle zehn CgGI-Mutanten zeigten eine 8- bis 16-fach höhere MHK nur für Imipenem (Tabellen 3 und S7). Fünf der zehn Mutanten wurden als MDRPs erkannt. Eine Nukleotideletion in oprD, die zu einer Frameshift-Mutation führte, wurde in CgGI44405 identifiziert (Tabelle 4), während das OprD-Protein in der Außenmembranfraktion nicht nachgewiesen wurde (Abb. 3).

Imipenem-resistente Mutanten (CgI-Mutanten) von CIP131 wurden mit 4 μg/ml Imipenem isoliert. Alle zehn CgI-Mutanten zeigten eine erhöhte Resistenz nur gegen Imipenem (Tabellen 3 und S8), und in oprD in CgI4401 wurde eine Ein-Nukleotid-Deletion (und eine Frameshift-Mutation) identifiziert (Tabelle 4). Das OprD-Protein wurde durch eine Immunoblot-Analyse nicht nachgewiesen (Abb. 3). Gentamicin-resistente Mutanten (CgIG-Mutanten) wurden mit 16 μg/ml Gentamicin isoliert. Diese Mutanten zeigten eine erhöhte MHK für Gentamicin, Amikacin, Ciprofloxacin und Levofloxacin (Tabellen 3 und S8). Eine höhere Expression von mexX wurde in CgIG44441 beobachtet (Abb. 1D). Acht Mutanten wurden als MDRP kategorisiert.

Wir haben die Häufigkeit des Auftretens von MDRP gemäß der MHK für Ciprofloxacin, Gentamicin und Imipenem berücksichtigt. Im Fall der GCI-, GIC- und IGC-Mutanten wurden alle Mutanten als MDRPs kategorisiert. Fünf von zehn CgGI-Mutanten zeigten eine MHK von 8 μg/ml für Imipenem, während die restlichen fünf 16 μg/ml aufwiesen. Da dieser Unterschied nur zweifach war, wurde er als vernachlässigbar angesehen. Die Reihenfolge von GCI, GIC, IGC und CgGI erhöhte die Auftrittsrate von MDRP.

MDRPs waren in CGI-Mutanten nicht enthalten. Unter den ICG-, CIG- und CgIG-Mutanten waren einige Stämme MDRPs. Viele MDRPs zeigten jedoch eine instabile Resistenz gegen Gentamicin. Ein und drei MDRPs waren ursprünglich in ICG- bzw. CIG-Mutanten enthalten; Allerdings verschwand die Gentamicin-Resistenz nach der Subkultur. Obwohl bei CgIG zunächst acht Isolate den MDRP-Phänotyp zeigten, handelte es sich bei sieben um instabile MDRPs.

Wir haben hier versucht, die Mechanismen zu klären, die zur Entstehung von MDRPs beitragen. Wie erwartet konnten wir keine MDRPs isolieren, nachdem wir nur einem Medikament ausgesetzt waren. Wir haben bisher auch keine MDRPs nach gleichzeitiger Exposition gegenüber drei Arzneimitteln isoliert. Wenn die Häufigkeit des Auftretens von Mutanten für jedes Medikament 10–8 beträgt, beträgt die Häufigkeit der dreifachen Resistenz 10–24. Diese Wahrscheinlichkeit ist nicht Null, aber in einem Labor oder einer klinischen Umgebung kaum zu erreichen. Andererseits wurden MDRPs nach einer aufeinanderfolgenden Exposition gegenüber jedem Arzneimittel erhalten. Wie viele Kliniker und Apotheker berichten, förderte die sequentielle Einnahme verschiedener Arten von Medikamenten die Entstehung von MDRP mit einem höheren Risiko.

Die Reihenfolge der Drogenexposition beeinflusste die Entstehung von MDRPs. Eine Gentamicin-Exposition vor Ciprofloxacin führte zu einer höheren Häufigkeit des Auftretens von MDRPs. Dieses Ergebnis zeigte, dass die Mechanismen, die der Ciprofloxacin-Resistenz zugrunde liegen, mit der Häufigkeit des Auftretens von MDRP zusammenhängen. Nach der ersten Exposition gegenüber Ciprofloxacin stiegen die MHK-Werte von Chloramphenicol, Erythromycin und Acriflavin sowie von Ciprofloxacin und Levofloxacin an. Solche Resistenzmuster stimmten mit den Transportsubstraten für MexCD-OprJ überein. Wie durch RT-PCR (Abb. 1B) gezeigt wurde, erhöhte sich die mexC-Expression in CIP126 signifikant. Ein ähnliches Phänomen wurde für IC-Mutanten von IPM429 beobachtet. Diese Ergebnisse deuteten auf einen Anstieg der Expression von mexC in Zellen hin, die Ciprofloxacin ausgesetzt waren, bevor die Expression von mexXY hochreguliert wurde. Andererseits war die Expression von mexXY in mit Ciprofloxacin behandelten Zellen, die Gentamicin ausgesetzt waren, bereits hochreguliert, und in allen Mutanten (GC-, IGC- und GIC-Mutanten) wurde eine Mutation in der DNA-Gyrase nachgewiesen. Daher kann die Reihenfolge der Exposition gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen den Resistenzmechanismus beeinflussen, nämlich eine Gyrase-Mutation oder die höhere Expression von mexCD-oprJ, wobei stabile MDRPs in bestimmten Reihenfolgen entstehen.

Bisher wurden mehrere Mechanismen der Aminoglykosidresistenz bei P. aeruginosa beschrieben, beispielsweise die Inaktivierung durch modifizierende Enzyme, Mutationen in Ribosomen und die Hyperexpression von mexXY15. Viele Mutanten zeigten in der vorliegenden Studie die Hyperexpression von mexXY. Darüber hinaus wurden Mutationen im Zusammenhang mit der Hyperexpression von mexXY gemeldet7,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Obwohl wir in unseren Mutanten noch keine Nukleotidveränderungen für die Gentamicin-Resistenz identifiziert haben, könnten sie einige wichtige Erkenntnisse über die Häufigkeit von MDRPs liefern.

Bei jedem Schritt der Isolierung von Gentamicin-Mutanten wurden mit einer bestimmten Häufigkeit auch instabile Gentamicin-resistente Mutanten isoliert. Dies könnte eine Art „adaptiver Widerstand“27 sein. In unseren Experimenten wurden stabile Gentamicin-Mutanten für den 2. oder 3. Schritt ausgewählt. Im 3. Schritt wurden nur sehr wenige stabile Gentamicin-Mutanten isoliert; Daher könnte die Stabilität der Gentamicin-Resistenz auch ein Schlüsselfaktor für die Inzidenz von MDRPs sein.

Der Erwerb exogener Gene könnte als Mechanismus für die Entstehung von MDRPs an klinischen Standorten wichtig sein. Das Modifikationsenzym für Gentamicin-Resistenz und die Metallo-β-Lactamase für Imipenem-Resistenz müssen berücksichtigt werden. Da der Erwerb exogener Gene im Labor nicht erfolgen kann, spiegeln die vorliegenden Ergebnisse möglicherweise nicht direkt die Mechanismen wider, die der Entstehung von MDRP unter klinischen Bedingungen zugrunde liegen. Die erhaltenen Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass Risikofaktoren für das Auftreten von MDRP (1) eine stabile Gentamicin-Resistenz und (2) eine Gentamicin-Exposition vor Ciprofloxacin sind. Wenn Ciprofloxacin zur Behandlung von Infektionen mit Stämmen verschrieben wird, die durch den Einbau exogener Gentamicin-Resistenzgene eine stabile Gentamicin-Resistenz entwickelt haben, kann die Häufigkeit von MDRP deutlich ansteigen. Die Aufdeckung der Prävalenz exogener Gentamicin-Resistenzgene im klinischen Umfeld könnte ein Gesamtbild der Entstehung von MDRP liefern.

Wir haben gezeigt, dass die Häufigkeit des Auftretens von MDRP je nach Reihenfolge der Exposition variiert; MDRPs traten häufiger auf, wenn Gentamicin vor Ciprofloxacin angewendet wurde, wurden jedoch selten isoliert, wenn Ciprofloxacin zuerst angewendet wurde. Und die Exposition gegenüber Ciprofloxacin, gefolgt von Gentamicin, erhöhte aufgrund der NfxB-Mutation die Expression von MexCD-OprJ, einer Multidrug-Effluxpumpe vom RND-Typ. Im Gegensatz dazu führte die Exposition gegenüber Gentamicin gefolgt von Ciprofloxacin zu mehr Mutationen in der DNA-Gyrase. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Art des Chinolon-Resistenzmechanismus mit der Häufigkeit von MDRP zusammenhängt und dass das Risiko einer MDRP-Inzidenz stark von der Reihenfolge der Exposition gegenüber Gentamicin und Ciprofloxacin abhängt.

Zellen von P. aeruginosa PAO1 oder Mutanten (107 bis 109 KBE) wurden in L-Medium (1,0 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt und 0,5 % NaCl, pH 7,0) gezüchtet und auf L-Agarplatten (1,0 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl und 1,5 % Agar, pH 7,0) mit 1 ×, 2 ×, 4 × MHK für einen der folgenden sieben antimikrobiellen Wirkstoffe: Carbenicillin, Imipenem, Amikacin, Gentamicin, Ciprofloxacin, Levofloxacin und Erythromycin. Wir erhielten viele Kolonien, die nach einer Inkubation bei 37 °C für 24–36 Stunden auf den Platten erschienen. Nach der Isolierung einzelner Kolonien wurden die Arzneimittelresistenzmuster der Mutanten untersucht. Amikacin (Wako, Kat. 014-24941), Carbenicillin (Wako, Kat. 037-23693), Ciprofloxacin (Wako, Kat. 032-18731), Gentamicin (Wako, Kat. 079-02973), Imipenem (Wako, Kat. 098-07283), Levofloxacin (Fluka, Kat. 28266) wurden von den angegebenen Herstellern gekauft.

Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) für verschiedene Arzneimittel wurden in Muller-Hinton-Bouillon (Difco) durch die Zweifachverdünnungsmethode gemäß den CLSI-Empfehlungen (CLSI, 2006) ermittelt. Zellen des Testmediums (105 Zellen ml−1) wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und anschließend das Wachstum gemessen.

RNA-Präparationen und Reverse-Transkriptions-PCR wurden gemäß den Protokollen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, wurde die gesamte bakterielle RNA aus Zellen isoliert, die mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) auf eine OD650 von 0,7 gezüchtet wurden. Restliche DNA wurde durch die Behandlung mit RNase-Free DNase (Promega) entfernt. Ein Nanogramm DNase-behandelte RNA wurde als Matrize für eine Reaktion unter Verwendung des Qiagen OneStep RT-PCR-Kits (Qiagen) verwendet. Primerpaare zum Nachweis von mRNA sind in Tabelle S9 aufgeführt. Als interne Kontrolle diente die Expression des rpsL-Gens. Die PCR-Zyklen betrugen 27 für mexA, 33 für mexC, 32 für mexX und 24 für rpsL. Die Produkte wurden mittels 3 %iger Agarosegel-Elektrophorese (Nipponge) aufgetrennt und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.

Die Herstellung von OprD erfolgte nach der zuvor beschriebenen Methode mit einer geringfügigen Modifikation28. P. aeruginosa-Zellen wurden bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD650 = 0,7) gezüchtet, geerntet und in 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) + 5 mM MgSO4 suspendiert. Die Zellen wurden mit dem Ultraschallgerät Vibra Cell VC505 aufgebrochen. Unzerstörte Zellen wurden entfernt, die Membranfraktion wurde durch Ultrazentrifugation (100.000 × g) hergestellt. Das Pellet wurde zweimal gewaschen und mit demselben Puffer gelöst. Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde wie zuvor beschrieben29 durchgeführt, 40 μg pro Probe. Die Proteine wurden auf einen Nitrozellulosemembranfilter (ADVANTEC Toyo) übertragen. Ein Kaninchen-Anti-OprD-Antikörper wurde freundlicherweise von Meiji Seika Pharma Co.30 zur Verfügung gestellt. Als zweiter Antikörper wurde ein Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Bioss Inc, Kat. bs-0295G-HRP) verwendet und OprD wurde mit dem ECL-System (Amersham Pharmacia Biotech) nachgewiesen.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir möchten Meiji Seika Pharma Co., Ltd. für die freundliche Bereitstellung des Kaninchen-Anti-OprD-Antikörpers danken. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant Number JP16390131 unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Nami Yasuda und Tomoko Fujita.

Abteilung für Mikrobiologie, Graduiertenschule für Medizin, Zahnmedizin und Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Okayama, 1-1-1, Tsushima-Naka, Kita-ku, Okayama, 700-8530, Japan

Nami Yasuda, Tomoko Fujita, Takahiro Fujioka, Mei Tagawa, Naoki Kohira, Daichi Morita, Wakano Ogawa, Tomofusa Tsuchiya und Teruo Kuroda

Abteilung für Mikrobiologie, Graduate School of Biomedical and Health Sciences, Universität Hiroshima, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8553, Japan

Kensho Torimaru, Takanori Kumagai, Daichi Morita und Teruo Kuroda

Abteilung für Molekularbiologie, School of Pharmacy, Shujitsu University, 1-6-1 Nishigawara, Naka-ku, Okayama, 703-8516, Japan

Sumiko Shiota

Abteilung für Mikrobiologie und Biochemie, Daiichi University of Pharmacy, 22-1, Tamagawa-Machi, Minami-ku, Fukuoka, 815-8511, Japan

Wakano Ogawa

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WO, TT und TK haben dieses Projekt geplant. DM und TK haben das Hauptmanuskript geschrieben. NY, TF, TF und NK isolierten Mutanten und führten den Arzneimittelempfindlichkeitstest und die RT-PCR durch. NY und DM führten die Western-Blot-Analyse durch. TF, MT und KT identifizierten Mutationsstellen. NY, TF, TF und TK haben Abbildungen und Tabellen erstellt. WO, SS, TK und DM führten kritische Diskussionen mit TK. Alle Autoren überprüften das Manuskript.

Korrespondenz mit Teruo Kuroda.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yasuda, N., Fujita, T., Fujioka, T. et al. Auswirkungen der Reihenfolge der Exposition gegenüber antimikrobiellen Mitteln auf die Inzidenz multiresistenter Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep 13, 8826 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35256-8

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Eingegangen: 24. Juni 2022

Angenommen: 15. Mai 2023

Veröffentlicht: 31. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35256-8

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